ПЦР диагностика – что это такое? Какие заболевания определяет

Диагностика методом ПЦР: современный подход выявления инфекционных и генетических заболеваний

За звучной аббревиатурой ПЦР скрывается сложная и не слишком понятная для рядового пациента расшифровка — полимеразная цепная реакция. Что же такое ПЦР-диагностика, на чем она основана и почему в последнее время ее стали считать самой перспективной технологией в постановке диагнозов, касающихся инфекционных и вирусных заболеваний? Мы расскажем о преимуществах ПЦР-метода, его особенностях и этапах проведения.

ПЦР-диагностика: что это такое?

Диагностика методом ПЦР существует чуть более 30 лет. Значительно эволюционировав за это время, она зарекомендовала себя как один из наиболее точных способов выявления инфекций. В основе метода лежит принцип многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. В результате сложного процесса, называемого амплификацией, под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) из одной молекулы ДНК образуется две. При этом происходит копирование участка ДНК, который присутствует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

Цикл образования новой молекулы ДНК занимает всего около 3 минут, а тридцати-сорока циклов вполне достаточно, чтобы получить количество молекул, необходимое для достоверного визуального определения методом электрофореза.

Кроме амплификации, то есть простого увеличения числа копий молекулы ДНК, с помощью ПЦР можно производить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Это позволяет использовать ПЦР не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

ПЦР-диагностика проводится в специальных лабораториях с помощью амплификационного оборудования. На сегодня существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии с использованием не только ДНК, но и фрагментов рибонуклеиновой кислоты (РНК). В некоторых из них амплификация осуществляется при постоянной температуре, и для их проведения специальное оборудование не требуется.

Широко применяется такой прием, как «горячий старт ПЦР», при котором пробирки с амплификационной смесью предварительно прогревают при температуре 95°С в течение 3–5 минут, для того чтобы избежать клонирования неспецифических ДНК-фрагментов.

Еще одна популярная модификация ПЦР — мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Это не только ускоряет и удешевляет проведение анализа, но и позволяет рассматривать одни фрагменты, получившиеся в результате реакции, в качестве положительных маркеров для других, что еще больше увеличивает точность исследования методом ПЦР.

Сферы применения метода в клинической медицине

В клинической медицине ПЦР-диагностика является одним из наиболее востребованных методов анализа в самых разных сферах:

  1. Урогинекология. Для инфекционных заболеваний такого рода характерны слабая выраженность симптомов и хроническое течение, нередко вызывающие бесплодие и невынашивание беременности у женщин. С помощью ПЦР можно выявить наличие целого «букета» половых инфекций: хламидиоза, нескольких видов микоплазмы, уреаплазмы, трихомониаза, гарднереллы, кандиды, гонококка, трепонемы. Кроме этого, ПЦР-диагностике поддается и группа вирусов, поражающих урогенитальный тракт у обоих полов, в особенности, вирус герпеса и вирус папилломы человека. Их своевременное выявление и лечение помогает избежать риска злокачественных заболеваний шейки матки у женщин.
  2. Неонатология. Существует множество микроорганизмов, способных поражать плод еще в утробе матери. ПЦР-диагностика позволяет эффективно выявлять наличие неонатальных инфекций как на внутриутробном этапе, так и у новорожденных. К опасным инфекциям относятся цитомегаловирус, токсоплазмы, вирусы краснухи и герпеса, хламидии, микоплазмы.
  3. Служба крови. Чтобы избежать риска переливания, пациентам инфицированной опасными заболеваниями крови или плазмы (ВИЧ, сифилис, гепатиты) также используется метод ПЦР. Он значительно превосходит по точности серологические методы, поскольку способен выделить даже те инфекции, которые имеют длительный инкубационный период и не определяются при помощи обычных исследований в течение первых нескольких недель.
  4. Клиника инфекционных заболеваний. К ним относятся вирус гепатита, СПИД, сальмонеллез, хеликобактериоз, холера, бруцеллез, туляремия, дифтерия, токсоплазмоз и другие инфекции.
  5. Фтизиатрия и пульмонология. ПЦР-диагностика позволяет выявить возбудителей атипичных пневмоний и рецидивирующих хронических бронхитов, которыми являются хламидии и микоплазмы. Кроме того, с ее помощью можно не только поставить диагноз, но и провести видовую идентификацию возбудителя, т.е. выявить конкретный штамм. Метод ПЦР используется также для ранней и высокоточной диагностики туберкулеза.

На заметку
ПЦР-диагностика используется в криминалистике для определения принадлежности найденного на месте преступления биоматериала, а также в экспериментальной медицине, создании генетических паспортов, мониторинге состояния окружающей среды, анализе продуктов питания, фармакологии, ветеринарии.

Преимущества ПЦР-диагностики

Хотя ПЦР-диагностика и является относительно «молодым» методом, широкое распространение в медицинской практике она получила благодаря явным преимуществам перед другими способами анализа:

  • Прямое определение возбудителя инфекции. Некоторые традиционные методы, такие как иммуноферментный анализ (ИФА), выделяют только белки-маркеры, которые являются продуктом жизнедеятельности возбудителей инфекции, а потому только косвенно указывают на присутствие микроорганизмов. Наличие специфического участка в ДНК, выявленное с помощью ПЦР, безошибочно или почти безошибочно указывает на присутствие конкретной инфекции.
  • Высокая специфичность метода. Она обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется фрагмент ДНК, характерный только для конкретного возбудителя инфекции. Специфичность исключает возможность ложных результатов анализа, тогда как в иммунологических методах исследований ошибки вполне вероятны из-за перекрестной реакции антигенов.
  • Высокая чувствительность. При помощи ПЦР-диагностики можно выявить присутствие в организме даже единичных клеток вирусов или бактерий в тех случаях, когда обычными методами сделать это практически невозможно. ПРЦ определяет наличие всего 10–100 клеток в пробе, тогда как иммунологическими и микроскопическими тестами можно определить наличие инфекции при количестве клеток не менее 103–105.
  • Универсальность. Сходство состава всех ДНК или РНК дает возможность применять универсальные методы лабораторных исследований, диагностируя сразу несколько возбудителей из одной биологической пробы.
  • Скорость получения результатов. Поскольку для проведения ПЦР-диагностики не нужен посев и выделение культуры возбудителя, то и большого количества времени на нее не требуется. Весь цикл — от забора биоматериала до получения результатов — занимает 4–5 часов.
  • Диагностика латентных инфекций. ПЦР-методом диагностируются трудно культивируемые и некультивируемые формы микроорганизмов, встречающиеся в тех случаях, когда заболевание протекает в скрытой форме.
Читайте также:
Повышенные тромбоциты у ребенка - причины и методы лечения

Методом ПЦР можно выявлять возбудителей инфекции не только в организме человека, но и в почве, воде, продуктах питания.

Ограничения метода

Тем не менее не стоит думать, что ПЦР-диагностика не имеет недостатков. У нее есть свои ограничения, но их количество настолько незначительно, что не может отрицательно повлиять на популярность и эффективность метода:

  • Вероятность амплификации ДНК не только живого, но и погибшего микроорганизма. При проведении ПЦР-диагностики для контроля эффективности лечения необходимо соблюдать определенные требования. В частности, проводить ПЦР нужно после определенного промежутка времени (1–2 месяца), за который происходит полное исчезновение возбудителя инфекции в организме.
  • Возможность возникновения перекрестной реакции. Подбор фрагментов ДНК (праймеров) осуществляется на основе знаний о генетическом строении конкретного микроорганизма. Но теоретически такой же фрагмент может присутствовать и у других микроорганизмов, геном которых на сегодняшний день еще не расшифрован. Их присутствие в пробе может привести к ложноположительному результату анализа.
  • Изменчивость микроорганизмов. Эта способность возбудителей к мутации иногда приводит к тому, что некоторые их штаммы становятся неуловимыми в процессе ПЦР-анализа.

Чтобы уменьшить риски, разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Этапы исследования методом ПЦР

ПЦР-диагностика проводится в специальной лаборатории в несколько этапов.

  1. Забор биоматериала. Процедура, предшествующая непосредственному анализу, которая осуществляется в процедурном кабинете соответствующего профиля. Забор делается с помощью стерильного оборудования только в стерильные пробирки. Материалом для исследования могут быть:
    • Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек: из уретры, из цервикального канала, со слизистой дыхательных путей и зева, из конъюнктивы. Забор проводится с помощью специального ершика, при этом недопустимо попадание в материал следов крови.
    • Моча. Собираются первые 50 г утренней мочи в стерильную емкость. Материал используется для диагностики мочеполовых инфекций.
    • Мокрота. Используется для ПЦР-диагностики туберкулеза и респираторных форм микоплазмоза и хламидиоза. Мокроту собирают в стерильный флакон в количестве 15–20 мг.
    • Кровь, сыворотка, плазма. С их помощью диагностируются гепатиты, герпес, ВИЧ-инфекция. Для анализа используется венозная кровь (1–1,5 мл), собранная у пациента натощак в стерильную пробирку. Хранить биоматериал можно не более суток при температуре 4°С. Замораживать кровь категорически запрещается.
    • Биологические жидкости. К ним относятся слюна, сок простаты, околоплодная, плевральная, спинномозговая, суставная жидкости. Собираются при помощи пункции с использованием стерильного инструментария в количестве 0,1–1,5 мл в стерильные пробирки.
    • Биоптаты, т.е. материалы, полученные путем биопсии. Обычно на анализ отправляют биоптаты двенадцатиперстной кишки или желудка, чтобы выявить хеликобактерную инфекцию. Объем материала 2–3 мм 3 .
  2. Хранение и транспортировка биоматериала. Хранить образцы можно при комнатной температуре не более 2 часов. Если необходимо длительное хранение, то пробы помещают в холодильник с температурой 2–8°С на срок не более одних суток. Допустимо хранение некоторых биоматериалов в течение двух недель в замороженном виде при температуре -20°С. Оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если она необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах с соблюдением всех правил хранения и перевозки биоматериалов.
  3. Выделение ДНК из образца. Способ выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца. Если, например, анализируется соскоб эпителиальных клеток, используется так называемый метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении в образец специального вещества, концентрации ДНК на сорбенте и его многократной отмывке буферным раствором.
  4. Проведение ПЦР. Некоторое количество образца из биологической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку. Туда же добавляется амплификационная смесь, имеющая сложный состав, в объеме 25 мл. Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическом режиме проводится амплификация. Время ее проведения зависит от заданной программы и составляет 2–3 часа. Одновременно с опытными пробами проводятся контрольные — положительные, включающие в себя контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя, и отрицательные, не содержащие исследуемую ДНК. Количество циклов амплификации варьирует от 30 до 40, более 40 циклов проводить не рекомендуется, так как это способствует увеличению количества неспецифических продуктов в пробе.
  5. Регистрация результатов. Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза в присутствии специального вещества — бромистого этидия. Его соединение с фрагментами ДНК дает светящиеся полосы при облучении ультрафиолетовым излучением. Образец помещают в камеру для электрофореза и в течение 35–40 минут проводят разделение продуктов амплификации. После этого образец просматривают в ультрафиолетовом свете — наличие оранжевой светящейся полосы свидетельствует о положительном результате.
  6. Интерпретация результатов исследования. Результат ПЦР-диагностики может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции, причем именно в данный момент времени. Количественный результат ПЦР-анализа оценить может только врач, они индивидуальны для разных типов инфекций. На основании количественного результата можно сделать вывод о степени активности заболевания и определить характер лечения.
Читайте также:
Радионуклидное сканирование

Цены на ПЦР-диагностику

Цена ПЦР-диагностики зависит от того, на какую конкретно инфекцию пациент планирует проверяться, от вида анализируемого материала, методики тестирования — качественной или количественной. Цена за определение одной инфекции составляет от 200 до 800 рублей в разных клиниках. Кроме того, к стоимости анализа добавится и плата за забор биоматериала — около 400 рублей. Средняя стоимость ПЦР-диагностики разных видов приведена в таблице 1.

Таблица 1. Примерные цены на анализы ПЦР в Москве

Название анализа Цена, руб.
Определение ДНК хламидия 750
Определение ДНК микоплазмы хоминис 540
Определение микоплазмы гениталиум 350
Определение ДНК уреаплазмы 350
Гонококк, определение ДНК 350
Определение ДНК герпеса (разные типы) 350–600
Определение ДНК кандиды 570
Вирус краснухи, определение РНК 800
Дифференцированное определение ДНК ВПЧ (разные типы) 350–1900 [1]

Итак, многие медицинские центры предлагают провести ПЦР-исследование комплексно. В пакет услуги диагностики включается сразу несколько анализов, например, «ПЦР-8» (8 бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций) — 1400 [2] рублей или «ПЦР-12» (12 половых инфекций) — 3500 [3] рублей. Такая услуга позволяет существенно сэкономить деньги, поскольку при отдельном прохождении ПЦР-диагностики по каждой инфекции затраты будут намного больше.

  • 1 http://www.diagnoze.ru/prices/pcr/
  • 2 https://www.invitro.ru/analizes/for-doctors/553/32680/
  • 3 http://www.diagnoze.ru/prices/pcr/

Вся информация, касающаяся здоровья и медицины, представлена исключительно в ознакомительных целях и не является поводом для самодиагностики или самолечения.

ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике

ПЦР – высокоточный метод диагностики и одно из самых главных открытий в области биологии за последние десятилетия. ПЦР-анализ применяется уже почти 40 лет и считается наиболее точным и чувствительным способом диагностики инфекционных заболеваний.

ПЦР – уникальный и универсальный метод, тест используется не только в клинической лабораторной диагностике, но также в биологии, криминалистике, археологии и многих других научных областях. Все, что нужно для проведения анализа – небольшое количество любого биоматериала пациента.

Суть метода ПЦР

ПЦР – полимеразная цепная реакция. Метод основан на обнаружении даже небольших концентраций искомого элемента диагностики. Для определения изначально крайне малых концентраций РНК или ДНК, которые необходимо определить в процессе проведения основного этапа исследования, используется метод искусственного увеличения количества РНК или ДНК. А поскольку они специфичны и строго индивидуальны для каждого микроорганизма или живого существа за счет уникальности последовательности нуклеотидов во фрагментах, ошибка в определении целевого ДНК или РНК исключена.

Генетическая информация любого живого организма записывается в ДНК. Эта молекула состоит из двух цепочек, сплетающихся в единую спираль. Некоторые вирусы (например, COVID-19) хранят свой код в РНК – одной нити нуклеотидов.

Для каждого организма, включая вирусы, бактерии и грибки, последовательность нуклеотидов уникальна. Ее можно сравнить с отпечатком пальца или сканом сетчатки глаза человека. Укороченные последовательности нуклеотидов, характерные для каждого вида патогена (возбудителя опасных заболеваний), хранятся в базах научных лабораторий в виде праймеров – отдельных участков ДНК, типичных для только конкретного возбудителя. Эти участки значительно короче любой молекулы ДНК. Такие праймеры присоединяются к ДНК возбудителя в пробе и под действием катализаторов многократно воспроизводят свои дубли. Этот процесс называются «репликация» – многократное увеличение, дублирование искомого участка до тех пор, пока он не станет доступен для определения. Процесс репликации возможен только при наличии в пробе ДНК возбудителя.

Преимущества метода ПЦР

  1. Высокая специфичность. Метод ПЦР определяет заданную последовательность нуклеотидов, присущую конкретному патогену. Таким образом, специфичность теста стремится к 100%. Исключен риск ложноположительных результатов.
  2. Чувствительность. Для ПЦР достаточно всего несколько молекул ДНК патогена (или даже уже неактивных – разрушенных вирусных частиц, сохранивших специфические участки ДНК в достаточном количестве), чтобы он был обнаружен в ходе исследования.
  3. Скорость проведения. Лаборатория получает результат ПЦР-теста через несколько часов, клиент – уже на следующий день. Скорость диагностики имеет принципиально важное значение для своевременного лечения. Например, при диагностике бактериальных инфекций классический посев занимает от нескольких дней, а с ПЦР-анализом пациент сможет принять меры и начать лечение уже через сутки.
  4. Универсальность. Для исследования подходит любой биоматериал: кровь, моча, сперма, мокрота, гной, жидкости из абсцессов и пр. Кроме этого, ПЦР применяется в самых разных областях науки и медицины, работая даже там, где другие методы бессильны.
  5. Диагностика латентных инфекций. ПЦР-диагностика определяет возбудителя инфекции даже в инкубационном периоде и при скрытом течении заболевания.

Какие есть недостатки

Единственный серьезный недостаток, связанный с методом полимеразной цепной реакции, – его высокая технологичность. Исследования ПЦР требуют строжайших соблюдений правил и серьезной оснащенности лабораторного комплекса. Не каждая лаборатория может позволить себе все необходимое оборудование.

Читайте также:
Повышены антитела к тиреопероксидазе - что это значит? Причины

Показания к проведению ПЦР-анализа

  • Диагностика инфекционных заболеваний (гепатит, ВИЧ, TORCH-инфекции и огромное множество других видов патогенов).
  • Урогинекология (диагностика инфекций, передающихся половым путем: хламидиоз, уреаплазма, микоплазма, кандиды, гарднерелла, герпесвирусы). Важное значение для женского и мужского здоровья играет ВПЧ – вирус папилломы человека. Доказано, что у женщин онкогенные штаммы этого вируса способны вызывать рак шейки матки.
  • Неонатология. Существует целый ряд инфекций, способных поражать плод еще в материнской утробе. Среди них вирусы герпеса, токсоплазмы, краснухи. ПЦР-диагностика позволяет правильно определить тактику ведения и риски внутриутробной инфекции.
  • Респираторные заболевания. Диагностика методом ПЦР стала в 2020 году актуальной как никогда и продемонстрировала свою незаменимость и эффективность. ПЦР-анализ – главный тест и «золотой стандарт» диагностики коронавирусной инфекции Sars-Cov-2 (COVID-19), ставшей причиной самой масштабной пандемии последних десятилетий.
  • Генетика. Наследственные заболевания и отцовство также диагностируются при помощи метода ПЦР.

Подготовка к проведению ПЦР-теста

  • Анализ сдается утром натощак. При этом ряд генетических исследований проводится в произвольное время, удобное пациенту.
  • При сдаче анализа по мазку из ротоглотки необходимо выдержать интервал с приемом пищи и воды в 3-4 часа перед тестом.
  • Перед анализом на венерические инфекции необходимо воздержаться от половой активности в течение суток.
  • Перед анализом нельзя использовать никакие противовирусные препараты.

Как проводится ПЦР-анализ

  1. С обратной транскрипцией. Самый распространенный способ идентификации известной последовательности РНК, включающий амплификацию, определение патогена и его идентификации среди образцов, хранящихся в научной картотеке.
  2. Вложенная ПЦР (или «гнездовая») — используется для снижения количества неспецифичных продуктов реакции и имеет две стадии с использованием двух видов праймеров.
  3. Изотермические методы – не требуют повторяющихся температурных циклов, менее энергозатратны.
  4. Инвертированная ПЦР — применяется, если имеется только короткий фрагмент известной последовательности, но необходимо определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном.
  5. ПЦР в реальном времени — метод, позволяющий определить не только присутствие целевой нуклеотидной последовательности в образце, но и измерять количество ее копий после каждого цикла амплификации, что дает возможность для проведения тестов с количественным результатом

Результаты ПЦР-теста

Результаты анализов, проведенных методом ПЦР, известны уже через один день. Иногда возможно проведение экстренного теста – его часто используют при оказании срочной медицинской помощи при госпитализации. Тогда срок готовности результата сокращается до считанных часов.

Результаты ПЦР-теста дадут точную информацию о том, какая инфекция была обнаружена. При количественном тестировании анализ определит также вирусную или бактериальную нагрузку на организм. В этом случае в результатах будет значиться титр обнаруженного патогена (его количество в одном миллилитре пробы). Количественный анализ особенно важен при диагностике заболеваний, спровоцированных условно-патогенными микроорганизмами, которые присутствуют в норме практически у каждого человека. Такие микроорганизмы представляют угрозу только при большой численности, а в остальных случаях мирно сосуществуют с носителем.

ПЦР-тест — что это такое простыми словами, что показывает ПЦР анализ и когда назначается

ПЦР расшифровывается как «полимеразная цепная реакция». Это метод лабораторной диагностики, цель которого заключается в выявлении возбудителя инфекционного заболевания. Он является золотым стандартом в диагностике возбудителей, который был многократно проверен. ПЦР дает возможность определить патогенный микроорганизм даже в том случае, если в исследуемом материале присутствует всего несколько его молекул ДНК.

Как работает ПЦР-анализ?

Практически все живые существа на планете, исключая некоторые вирусы с РНК-геномами, имеют генетический материал, представленный длинной двухцепочной молекулой ДНК. Цепочка ДНК включает нуклеотиды — небольшие молекулы с универсальным строением. Они могут идти в цепочке ДНК в разном порядке. В зависимости от этого «собираются» разные геномы.

У каждого болезнетворного микроорганизма есть свой, уникальный порядок построения цепочки ДНК, поэтому его невозможно спутать с ДНК человека.

При проведении теста ПЦР используют фрагмент чужеродного генетического материала, добытый из образца, и размножают много раз с помощью белка-фермента. За несколько часов количество копий увеличивается в несколько миллиардов раз. Это позволяет получить такое количество ДНК, которого достаточно для успешного определения его природы.

В лабораториях используют определенный набор реактивов для каждого конкретного микроорганизма, поэтому пациентам назначают не общий ПЦР-анализ, а тест на конкретный микроорганизм (например, на вирус гепатита С).

Полимеразная цепная реакция проводится качественно и количественно. Качественный тест позволяет определить, есть ли в образце генетический материал микроорганизма (вируса или бактерии), который ищет врач. Количественный тест дает информацию о том, в каком количестве содержится материал.

Преимущества ПЦР-анализа

К достоинствам этого диагностического метода относят:

  1. Универсальность. ПЦР-тест обнаруживает любые ДНК и РНК, даже в тех случаях, если другие диагностические методы не дали результата.
  2. Эффективность. Полимеразная цепная реакция позволяет диагностировать некультивируемые, трудно культивируемые и латентно существующие формы патогенных микроорганизмов.
  3. Высокую чувствительность. Даже если в исследуемом материале присутствует всего один фрагмент генетического материала возбудителя, тест все равно показывает его.
  4. Высокую специфичность метода, достигающую 100%. В ходе диагностики выявляют уникальную последовательность нуклеотидов в цепочке ДНК, характерную только для конкретного патогенного микроорганизма, провоцирующего развитие заболевания.
  5. Высокую скорость выполнения. Для установки реакции достаточно несколько часов. Пациент получает результаты анализа на следующий день после сдачи.

ПЦР-тест направлен на определение возбудителя заболевания, а не на реакцию на его проникновение со стороны организма.

Читайте также:
Колоноскопия кишечника - что это такое и подготовка к процедуре

Показания к проведению ПЦР-теста

Анализ проводят при инфекционных заболеваниях для определения природы их возбудителя. Также его назначают при:

  • необходимости точно установить конкретный болезнетворный микроорганизм;
  • диагностике лейкоза и других злокачественных новообразований;
  • диагностике некоторых генетически обусловленных заболеваний;
  • исследовании образцов биопсии, которые невозможно изучить с помощью других методов.

С помощью ПЦР-анализа выявляют различные заболевания:

  • инфекционные (ВИЧ, гепатит, ТОРЧ-инфекции и т.д.);
  • передающиеся половым путем (хламидии, микоплазмы, кандиды);
  • внутриутробные инфекции (вирусы краснухи, герпеса, токсоплазмы);
  • респираторные (в настоящее время ПЦР-тест является золотым стандартом в диагностике вируса Ковид-19);
  • генетические.

С помощью ПЦР можно провести тест на определение отцовства.

Типы ПЦР

Диагностика на основе полимеразной цепной реакции имеет несколько разновидностей. Она может быть:

  • инвертированной;
  • с обратной транскрипцией;
  • количественной;
  • вложенной;
  • ступенчатой.

Наиболее надежный метод — ПЦР в режиме реального времени. Это количественный или полуколичественный способ диагностики, который предусматривает постоянное наблюдение образца генетического материала датчиком. Последний регистрирует сигналы на каждом цикле реакции.

Подготовка к анализу

При подготовке к ПЦР-анализу нужно соблюдать несколько правил:

  1. За 10-14 дней до назначенного теста прекратить прием любых препаратов и отказаться от проведения лечебных процедур, включая физиотерапевтические. Если прием лекарственных средств жизненно необходим, об этом нужно предупредить врача заранее.
  2. В случае забора мазка на выявление заболеваний, передающихся половым путем, нужно в течение суток перед исследованием отказаться от спринцеваний, использования тампонов и лечебных суппозиториев, применения антисептических средств. Также в этот период необходимо воздерживаться от половых актов. За 2 часа до забора мазка нельзя мочиться.
  3. Если выполняется забор мазка из зева, за 3 часа до анализа нельзя чистить зубы, пить, полоскать рот (даже простой водой).
  4. За трое суток до сдачи материала на ПЦР-исследование нужно полностью отказаться от употребления алкоголя.
  5. За двое суток до проведения теста нужно исключить повышенные физические нагрузки.

Материалы для ПЦР-анализа

В зависимости от направленности теста ПЦР, в качестве материала для исследования используют:

  • кровь (сыворотка или плазма);
  • соскобы эпителиальных клеток (с кожных покровов, слизистой оболочки уретры, цервикального канала);
  • различные биологические жидкости (околоплодная, суставная, спинномозговая жидкости, секрет предстательной железы);
  • мазок из зева;
  • различные биологические выделения (слюна, моча, мокрота);
  • биоптат (материал, полученный путем проведения биопсии).

Расшифровка результатов ПЦР-тестирования

Результат ПЦР-анализа либо положительный, либо отрицательный. Положительный указывает на то, что у человека присутствуют фрагменты ДНК возбудителя заболевания, то есть, что человек заражен и ему необходимо лечение. Отрицательный результат ПЦР-анализа свидетельствует об отсутствии следов ДНК патогена. В таком случае человек здоров.

В некоторых случаях ПЦР-тест дает положительный результат, хотя человек не ощущает недомогания и специфических симптомов заражения. Это значит, что заболевание выявлено на ранней стадии развития. Для уточнения диагноза назначают дополнительные исследования, а затем, с учетом их результата, начинают курс лечения.

ПЦР-диагностика

Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).

Принцип ПЦР- исследования

У каждого живого существа, по крайней мере, на нашей планете, есть уникальный «отпечаток» – ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), которая отвечает за передачу наследственных факторов от предков к потомкам. Структурно эта молекула представляет собой две нити из молекул-азотитых оснований, удерживаемые рядом друг с другом химическими связями и скрученные в спираль (считается, что для компактности). Из курса биологии вы можете помнить такие названия, как аденин (А), гуанин (Г), тимидин (Т) и цитозин (ц). Это 4 нуклеотида, которые и создают последовательность ДНК. Вирусы хранят свою генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте – РНК.
Информация об уже изученных ДНК и РНК хранится в научных базах лабораторий. После того, как был изобретен метод ПЦР, для многих возбудителей различных заболеваний (бактерии, грибки и вирусы) были созданы свои специфические генетические детекторы (праймеры) – уникальные последовательности нуклеотидов, характерных только для конкретного возбудителя. И если поместить их в пробирку с исследуемым материалом, при наличии в нем ДНК или РНК «живых» возбудителей, праймеры запускают реакцию репликации – создания огромного числа копий, которое можно идентифицировать визуально. Т.е. они начинают копировать свою ДНК/РНК десятки раз.
И при подсчете результатов сотрудники лаборатории могут понять, есть ли искомые бактерии и вирусы в исследуемом образце, или нет, именно поэтому результаты ПЦР чаще всего качественные, т.е. «обнаружено» или «не обнаружено».

Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?

Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.

Читайте также:
Повышены лейкоциты в крови - что это значит и что делать?

Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.

В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.

Как это все происходит в лаборатории

pcr-LQ2.jpg

Выделение ДНК

Сначала пробу биологического материала подготавливают: центрифугируют, осаждают и т.д. Затем лаборантам необходимо выделить ДНК из полученного биологического концентрата.
Амплификация (увеличение числа копий ДНК)
Важнейший этап исследования. Проводится в термоциклере и именно здесь проходят все процессы, подпадающие под определение полимеразно-цепная реакция: денатурация, отжиг, элонгация.
Денатурация
Самый первый этап – развернуть (денатурировать) нуклеиновые кислоты, чтоб сделать их доступными для дальнейшей работы. Осуществляется путем нагрева реакционной смеси до 80-90 °C.
Отжиг
Денатурированные (распущенные) ДНК/РНК обрабатывают праймерами – изготовленными в лабораторных условиях коротенькими цепочками нуклеиновых кислот. Благодаря запрограммированному участку, праймеры прикрепляются только к тем нуклеиновым кислотам, для которых были созданы. Например, праймер для вируса простого герпеса 1 типа, никогда не свяжется с ДНК другого вируса, микроорганизма или клетки.
Именно праймеры обусловливают крайне высокую специфичность ПЦР – способность реагировать только на нуклеиновые молекулы конкретных типов, видов классов и даже штаммов микроорганизмов. Или отдельные виды клеток живых организмов.

Элонгация

Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот.
Такой температурный цикл проводится 30 и более раз. В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.

Детекция

Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:

  1. Электрофорез в вязкой среде. Суть в том, что ДНК/РНК заряжены электрически и движутся к одному из электродов. В среду (агар или полиакридный гель) добавляют краситель ДНК (например – бромистый этидий). В процессе сеанса электрофореза, молекулы нуклеиновых кислот движутся и формируют скопления, подкрашенные этидием. Под ультрафиолетом, это выглядит в виде полосок разной толщины и яркости.
  2. Метод гибридизации. Используются праймеры, заранее помеченные люминофором (флуорофором). После нужного числа температурных циклов, применяют специальный прибор – детектор флюоресценции. За счет того, что в образец можно добавлять флуорофоры для разных мишеней (они будут и светиться под ультрафиолетом разным цветом), метод гибридизации подходит для диагностики сразу нескольких мишеней в одном образце.
  3. ПЦР диагностика в реальном времени (real-time PCR). Отличается тем, что детекция проводится прямо в процессе амплификации. Для этого нужны зонды-люминофоры (из предыдущего пункта) и специальные приборы ДНК-амплификаторы. Эти устройства оценивают нарастание яркости люминофора после каждого температурного цикла и впоследствии, вычисляют исходное число искомых нуклеиновых кислот в образце.

Преимущества методики ПЦР

Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).

pcr-01LQ.jpg

Области применения в медицине

В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др.
Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.). А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию.
Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ. Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа.
В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.
Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов.
Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка. Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого.
Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.

Читайте также:
Бактерии в моче - что это значит? Причины и расшифровка результата

ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Специфичность и применение

ПЦР – метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.

ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).

    Исследование урогенитального тракта методом ПЦР на ИППП ;

Выявление ДНК хламидий, гонококка, трихомонады, микоплазмы гениталиум, вируса простого герпеса 1-го и 2-го типов, цитомегаловируса в урогенитальном соскобе используется для подтверждения инфицированности при наличии клинических признаков воспаления урогенитального тракта, для дифференциальной диагностики урогенитальных инфекций.

    тест методом ПЦР на коронавирус Covid-19, мазок из носа и зева на определение РНК вируса SARS-CoV-2;

• Определение РНК вируса SARS-CoV-2 (все виды известных штаммов, включая Delta и Omicron)
• Производитель – АО Вектор-Бест
• Возможен предварительный заказ на сайте
• Справка о результатах анализа на русском и английском языках
• Справка выдается только при отрицательном результате исследования!

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т. д.). В урологической и гинекологической практике – для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллёза, микоплазменной инфекции, ВПЧ – вирусов папилломы человека; в пульмонологии – для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулёза; в гастроэнтерологии – для выявления хеликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний – в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии – для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов.

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами – короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 – 30 букв. Каждый из праймеров сопоставим (комплементарен) с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

После соединения (гибридизации) матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

Проведение ПЦР

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

  • ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;
  • два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента;
  • термостабильная ДНК-полимераза;
  • дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);
  • ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы;
  • буферный раствор.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.

Ход реакции

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 – 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 – 96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 – 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 – 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4 – 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5 – 2 минут.

Читайте также:
На каком дне тест показывает беременность? Когда можно его делать

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 – 15 мин.

Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию

Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Известно, что в лабораторной диагностике большинство ошибок (до 70%) совершается именно на этапе пробоподготовки. Для взятия крови в лаборатории ИНВИТРО в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой – позволяют произвести взятие материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации (загрязнения) материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР.

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота – биологический полимер, один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Основная роль ДНК в клетках — долговременное хранение информации о структуре РНК и белков.

РНК– рибонуклеиновая кислота – биологический полимер, близкий по своему химическому строению к ДНК. Молекула РНК построена из тех же мономерных звеньев – нуклеотидов, что и ДНК. В природе РНК, как правило, существует в виде одиночной цепочки. У некоторых вирусов РНК является носителем генетической информации. В клетке играет важную роль при передаче информации от ДНК к белку. РНК синтезируется на ДНК-матрице. Процесс этот называется транскрипцией. В ДНК имеются участки, где содержится информация, ответственная за синтез трех видов РНК, различающихся по выполняемым функциям: информационной или матричной РНК (мРНК), рибосомальной (рРНК) и транспортной (тРНК). Все три вида РНК тем или иным способом участвуют в синтезе белка. Однако информация по синтезу белка содержится только в мРНК.

Нуклеоти́ды – основная повторяющаяся единица в молекулах нуклеиновых кислот, продукт химического соединения азотистого основания, пятиуглеродного сахара (пентозы) и одной или нескольких фосфатных групп. Нуклеотиды, представленные в нуклеиновых кислотах, содержат одну фосфатную группу. Они называются по содержащемуся в них азотистому основанию – адениновый (A), содержащий аденин, гуаниновый (G) – гуанин, цитозиновый (C) – цитозин, тиминовый (Т) – тимин, урациловый (U) – урацил. В состав ДНК входят 4 типа нуклеотидов – A, T, G, C, в состав РНК также 4 типа – A, U, G, C. Сахаром в составе всех нуклеотидов ДНК является дезоксирибоза, РНК – рибоза. При образовании нуклеиновых кислот нуклеотиды, связываясь, образуют сахаро-фосфатный остов молекулы, по одну сторону которого находятся основания.

Праймер – котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

  1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. — 589 с., илл. ISBN 5-03-003328-9
  2. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. — 496 с.; илл. ISBN 5-94087-098-8
  3. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы — М.: Наука, 2005 — В 2 т. — ISBN 5-02-033278-X
  4. http://ru.wikipedia.org/wiki
ВАЖНО!

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Анализ ПЦР — самый точный анализ на инфекции

Анализ ПЦР — самый точный анализ на инфекции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это современный инструмент диагностики разнообразных инфекций, отличающийся высокой точностью. Анализ ПЦР позволяет определять возбудителей инфекционных заболеваний, опираясь на их генетический материал (РНК или ДНК). Биологическим материалом для исследования может служить кровь, мазок из половых органов, слюна и прочее.

Метод ПЦР был открыт в 1983. Его создатель Кэри Мюллис (США), за это открытие получил Нобелевскую премию в области химии. Уже за первые десять лет методика стала обязательным лабораторным исследованием во всем мире, получив признание ученых и врачей.

Анализ ПЦР в клинике ДИАНА

Медицинский центр Диана предлагает провести исследование по методике полимеразной цепной реакции в кратчайшие сроки и с высочайшим уровнем точности. Наша диагностическая база соответствует всем международным стандартам и требованиям.

Какие инфекции можно диагностировать методом ПЦР

На диагностику отправляют гинеколог, уролог или дерматолог. Анализ ПЦР дает возможность диагностировать большое число разнообразных инфекций. В эту группу попадают и скрытые, бессимптомные заболевания, находящиеся в инкубационном периоде:

С помощью метода ПЦР можно обнаружить:

  • гепатит C, B;
  • уреаплазмоз половых органов;
  • ИППП – уреаплазмоз, трихомониаз, гарднереллез,;
  • хламидиоз половых органов и дыхательных путей;
  • микоплазмоз половых органов и дыхательных путей;
  • бактериальный вагиноз;
  • кандидоз половых органов;
  • инфекционный мононуклеоз;
  • туберкулез;
  • сальмонеллез;
  • туберкулез (легочные и внелегочные формы);
  • листериоз, клещевые энцефалиты, болезнь Лайма;
  • цитомегаловирусную, папилломавирусную, герпесную инфекцию;
  • детские заразные болезни, выявляемые при беременности и до зачатия — краснуху, паротит, дифтерию, корь;
  • ВИЧ.
Читайте также:
Компьютерная томография - как проводится процедура и подготовка

При каждом из вышеперечисленных заболеваний, обнаруженным другим методом, желательно делать и ПЦР — исследование. Возбудители многих инфекций имеют несколько типов (штаммов), а более точная диагностика делает лечение эффективнее. Поскольку разные типы возбудителей обладают своими способами передачи инфекции, точное определение возбудителя помогает уберечь от заражения окружающих. Например, гепатитом А можно заразиться через общие предметы и посуду (болезнь грязных рук), а гепатитом С — только через кровь, медицинские инструменты и половые контакты. Это важно для тех, кто находится рядом с больным.

Суть метода полимеразной цепной реакции

Метод основан на выявлении возбудителя по участкам ДНК или РНК. ПЦР напоминает криминалистику, когда преступника находят по частичкам кожи или волосам, оставленным на месте преступления. Поскольку каждый живой организм имеет уникальную структуру ДНК или РНК. Метод позволяет безошибочно идентифицировать микроорганизм, даже если он присутствует в исследуемом материале в минимальных количествах.

ПРЦ подходит для выявления скрытого носительства, нетипичных, стертых и прочих форм заразных заболеваний. Диагностика отличается высокой точностью, поэтому практически не дает ошибок и ложных результатов. Анализ часто назначается, как дополнительное обследование, чтобы выявить конкретный тип вируса или микроба.

Достоинства и недостатки метода ПЦР

Анализ ПЦР – результативный диагностический инструмент, позволяющий врачу не только правильно определить тип инфекционного возбудителя в организме больного, но также и количество микробов. Эта особенность позволяет методу ПЦР эффективно обнаруживать и хронические инфекции, к примеру, вирусный гепатит.

Преимущества методики заключаются в следующих особенностях:

  • Универсальность . Метод дает возможность определить все известные на сегодняшний день микроорганизмы, вне зависимости от вида исследуемого материала.
  • Специфичность . ПЦР позволяет определить ДНК вируса или бактерии со 100% точностью, что не дает ни один другой способ диагностики.
  • Чувствительность – даже один мельчайший «обломок» ДНК или РНК может быть обнаружен и идентифицирован, благодаря быстрой реакции образования копий.
  • Оперативность – поставить диагноз на основании полимеразной цепной реакции можно уже через несколько часов после забора биологического материала, что дает возможность своевременно приступить к лечению заболевания.
  • Возможность проведения количественного анализа . Эта особенность важна при выявлении болезней, вызванных условно-патогенной флорой (например, молочницы). Повышенное содержание грибков кандида в организме вызывает заболевание, а нормальное количество до 10 3 — 104 КОЕ/тамп. – нет.

Недостатки ПЦР-диагностики – это необходимость в высокотехнологичном оборудовании и высококвалифицированных специалистах. Для анализа нужен специальный бокс-ламинар, где поддерживается необходимая температура и обеспечивается чистота эксперимента.

Как сдать анализ ПЦР правильно: подготовка

Чтобы понять, как именно следует подготовиться к предстоящему анализу ПЦР, пациент должен обязательно уточнить у своего врача, какой именно биологический материал планируется взять. От этого непосредственно зависит подготовка.

  • Выделения из половых органов, мазок из шейки матки или мочеиспускательного канала, моча – посредством исследования данных вариантов материала методом ПЦР эффективно диагностируются инфекции половых органов.
  • Вирусный гепатит C, ВИЧ инфекция требуют взятие крови на анализ ПЦР.
  • С помощью мазка из зева можно подтвердить или опровергнуть факт наличия инфекционного мононуклеоза.

Мазок у женщин

Для диагностики половых инфекций методом ПЦР у женщин, как правило, берут мазок из влагалища . При беременности действуют стандартные правила подготовки к анализу ПЦР.

  • За пару дней до проведения ПЦР нужно отказаться от спринцеваний, средств интимной гигиены.
  • За неделю до анализа на инфекции стоит перестать применять любые виды лекарственных препаратов, разумеется, если они не входят в программу подготовки к анализу ПЦР, прописанную врачом.
  • За пару дней до обследования нужно начать воздерживаться от полового акта.
  • Подмывание в день анализа ПЦР не нужно, гигиена половых органов проводится накануне вечером, используется только теплая вода.
  • За пару часов до сдачи анализа мочиться нельзя.

Мазок у мужчин

Подготовиться к забору мазка из мочеиспускательного канала для проведения ПЦР несложно. Достаточно соблюдать изложенные ниже правила.

  • За 2 суток до ПЦР обследования нужно начать воздерживаться от сексуальных отношений.
  • Прием лекарств прекращается приблизительно за 7 дней до проведения анализа, если, конечно же, они не были специально назначены врачом.
  • Гигиена половых органов должна проводиться накануне вечером, в день анализа ПЦР это делать не стоит.
  • Рекомендуется не мочиться примерно 2-3 часа перед сдачей анализа.

Анализ крови

Если в процессе ПЦР анализа объектом изучения станет кровь пациента, правила подготовки к нему следующие.

  • Оптимальное время для сдачи крови – утро, анализ нужно обязательно сдавать натощак (минимум 8 часов отсутствия пищи). Воду можно пить свободно.
  • Отказ от алкоголя за сутки до ПЦР анализа, отказ от курения за час до него.
  • Если здоровье допускает такой вариант, от приема лекарственных средств рекомендуется на время отказаться.
  • Перед сдачей проб крови в обязательном порядке следует отдохнуть около 20 минут.
  • Накануне ПЦР исследования совершенно исключены эмоциональные и физические перегрузки, они могут сказаться на результатах анализа.
Читайте также:
Повышены лимфоциты в крови - что это значит? Причины и лечение

Как проводится тест ПЦР?

Для исследования берется любая среда, в которой может находиться возбудитель, но чаще всего используются:

  • Кровь сыворотка или плазма – для выявления множества возбудителей – вирусов гепатита B, C, D, G, герпеса, ВИЧ, цитомегаловируса;
  • Моча и сок простаты – при диагностике ЗППП;
  • Мокрота, плевральная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж – для диагностики легочных и внелёгочных форм туберкулеза;
  • Спинномозговая жидкость – для диагностики инфекций нервной системы;
  • Околоплодная жидкость – для определения внутриутробных заражений;
  • Мазок из зева – для выявления возбудителей инфекционного мононуклеоза и дифтерии;
    соскобы и мазки со слизистых для диагностики ЗППП;
    клетки слизистой желудка и желудочный сок — для выявления бактерии хеликобактер, вызывающей гастрит и язву.

При одном взятии материала можно обнаружить сразу нескольких возбудителей, попавших в организм. Такая универсальность избавляет пациента от дополнительных обследований и лишних трат.

Обнаружить и идентифицировать участки генетической информации удается при помощи специальных эталонных маркеров ДНК (праймеров) созданных для каждого известного возбудителя. Эталон позволяет найти «свой» фрагмент среди миллионов других. Если это происходит, запускается реакция полимеразной цепи.

пцр анализ

ПЦР—реакция делает огромное число копий выявленного участка генной информации (репликацию). Важно, что реплицируются только участки ДНК и РНК, необходимые для проведения анализа. Поэтому так важны чистота эксперимента и умение персонала обращаться с аппаратурой и образцами.

Цепная реакция протекает очень быстро, уже через два часа участок ДНК увеличивается в миллионы раз, что позволяет обнаружить и точно идентифицировать инфекцию. Для работы с эталонами пробирки помещают в специальный прибор. При помощи программы задается алгоритм, несколько раз меняющий температуру среды и влияющий на протекание реакции. Результат ПЦР виден сразу после окончания исследования.

Как расшифровать ПЦР анализ

Проведение ПЦР исследования позволяет не просто установить тип инфекции, присутствующий в организме больного, но и оценить его с количественной точки зрения (количество микробов). Расшифровка результатов количественного анализа ПЦР играет важную роль в обнаружении и проверке эффективности лечения большого числа хронических заболеваний, скажем гепатита C.

Результатом анализа ПЦР могут стать положительный и отрицательный ответы.

  • Отрицательный результат. Следы инфекции не были выявлены в биологическом материале, который являлся объектом исследования в процессе анализа ПЦР. Как правило, на основании отрицательного результата можно полагать, что в организме действительно отсутствует инфекция.
  • Положительный результат. Такой результат анализа ПЦР свидетельствует о том, что следы инфекционного заболевания присутствуют в биологическом материале пациента. Положительный результат анализа ПЦР характеризуется большой степенью точности.

Иногда инфицирование выявляется на фоне полного здоровья и отсутствия признаков заболевания. Некоторые больные считают, что анализ сделан неправильно, но реальная ситуация другая. Если ПЦР показала, что возбудитель в организме есть, значит, он там действительно находится. Просто инфекционные болезни никогда не начинаются сразу после заражения, имея инкубационный период различной продолжительности.

Скрытый период может продолжаться очень долго, например, при СПИДе – несколько лет, пока какие-то механизмы не подтолкнут вирусы к размножению. Возбудитель определяется в организме носителей и тех, кто не долечился. Очень часто переходят в скрытую (латентную) форму различные ЗППП. В этом случае может понадобиться дополнительная лабораторная диагностика.

Точность расшифровки результатов ПЦР анализа

Метод ПЦР, позволяющий выявлять достаточно большое число инфекций, характеризуется повышенной точностью, чувствительностью и специфичностью. Эти характеристики говорят о том, что с помощью исследования ПЦР можно:

  • Максимально точно установить отсутствие или присутствие инфекционного возбудителя.
  • Максимально точно определить конкретную разновидность инфекционного возбудителя (специфичность).
  • Выявить инфекцию даже в том случае, когда она имеет скрытый характер. Речь идет о низком уровне присутствия в подвергаемом исследованию биологическом материале пациента ДНК микробов (чувствительность).

Преимущества метода ПЦР над иммуноферментным анализом и прочими иммунологическими инструментами выявления инфекции заключается в том, что он реже дает ошибочные результаты. То есть расшифровка анализа ПЦР значительно реже показывает отсутствие инфекционных микробов, если они есть в организме больного.

Кроме того, почти не бывает, чтобы расшифровка анализа выявляла наличие в организме несуществующей инфекции, то есть давала ложноположительные результаты.Разумеется, стопроцентно правильными результаты ПЦР назвать все же нельзя, поэтому необходимо обязательно дополнять это исследование другими методиками.

Диагностика инфекций методом ПЦР: что это такое?

Перечень анализов, проводимых при помощи ПЦР-диагностики расширяется с каждым днём. Что это за метод, как его проводят и в чём его достоинства? На эти и другие вопросы отвечает Владислав Александрович Чередниченко, врач-инфекционист, заместитель директора по развитию «Клиника Эксперт» Воронеж.

– Владислав Александрович, ПЦР – что это такое?

ПЦР или, иначе, полимеразная цепная реакция – это современный высокоинформативный метод молекулярно-генетической диагностики, активно применяемый для выявления у человека различных инфекционных и наследственных заболеваний.

За создание метода ПЦР американский биохимик Кэри Муллис был удостоен Нобелевской премии

– Как давно появилась ПЦР-диагностика и насколько она распространена сегодня?

Официальной датой изобретения этого метода диагностики считают 1983 год, а «родителем» – американского биохимика Кэри Муллиса. Он хотел создать метод, благодаря которому можно было бы амплифицировать ДНК (увеличивать число её копий) в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Это событие стало поистине революционным и оказало в последующем серьёзное влияние на развитие молекулярной биологии, генетики и медицины. Подтверждение этому – Нобелевская премия в области химии, которой был удостоен К. Муллис в 1993 году.

Читайте также:
Назначили сцинтиграфию, но рассказали о ней

Кэри Муллис

Сегодня без ПЦР-диагностики в клинической медицине практически невозможно обойтись. Высочайшая чувствительность метода позволяет опираться на него при выявлении различных инфекционных агентов в разных аспектах - как в качественном (возбудитель есть или нет), так и в количественном (какое количество микроорганизмов).

Помимо медицины метод нашёл применение в генетике, криминалистике, археологии.

– Для выявления каких заболеваний назначают проведение ПЦР?

Универсальность метода позволяет применять его для диагностики большинства патологий вирусной, бактериальной, грибковой природы, а также вызываемых гельминтами и простейшими. Например, метод ПЦР активно используется для выявления таких болезней инфекционной природы, как ВИЧ, гепатиты всех видов, уреаплазмоз, хламидиоз, микоплазмоз, кандидоз, мононуклеоз, трихомониаз, герпетические инфекции, сальмонеллёз, туберкулёз и многие другие.

Читайте материалы по теме:

– Какой биологический материал исследуют при ПЦР-диагностике?

Все биологические среды и жидкости человека: кровь, мочу, кал, мокроту, слюну, сок простаты, сперму, спинномозговую и суставную жидкость, и другие. Выбор биологического материала зависит от локализации возбудителя. К примеру, для проведения ПЦР на обнаружение хламидии, уреаплазмы или герпеса используют соскобы со слизистых оболочек, для выполнения ПЦР на гепатиты А, В, С и др. требуется кровь, а ПЦР-анализ на выявление туберкулёза лёгких будет максимально информативным при исследовании мокроты пациента. Использование метода полимеразной цепной реакции при изучении биоптатов из органов желудочно-кишечного тракта позволяет обнаружить хеликобактерную инфекцию.

О хеликобактере пилори и истории его открытия – наши статьи:

– Как проводится процедура ПЦР? В чём её суть?

Любой живой организм обладает своей уникальной «визитной карточкой» – молекулой ДНК или РНК с расположенным в ней набором генов. Эта молекула состоит из звеньев – нуклеотидов. У каждого микробного агента нуклеотиды расположены в определённом порядке и комбинации. Взятый у пациента биоматериал может содержать фрагменты ДНК или РНК инфекционного возбудителя, однако его обычно крайне мало для определения принадлежности микроорганизма к какому-либо из видов. Вот тут на помощь и приходит полимеразная цепная реакция.

Суть ПЦР в том, что берётся малое количество ДНК или РНК-содержащего материала для исследования, а реакция способствует увеличению количества генетического материала, принадлежащего конкретному возбудителю, поэтому становится возможным его идентификация.

Пациента обычно отправляет на ПЦР-диагностику лечащий врач. В процедурном кабинете или в кабинете специалиста у пациента берут необходимый биоматериал, который упаковывается с соблюдением условий стерильности, температурного режима и маркировки. Затем биоматериал отправляют в ПЦР-лабораторию, где помещают в специальный аппарат, в котором происходит три этапа трансформации биоматериала.

Через 1-2 дня пациент получает результаты исследования.

– Требуется ли для проведения ПЦР-исследования специальная подготовка?

Нет, но рекомендуется придерживаться некоторых правил. Кровь для анализа сдают натощак. Слюну, мокроту, мочу и кал собирают в чистую посуду. Перед сдачей материала из половых путей для диагностики заболеваний мочеполовой системы следует на протяжении двух суток воздержаться от половой жизни. Также целесообразно перед исследованием уточнять особенности подготовки в лечебном учреждении либо в лаборатории.

А как готовиться к другим распространённым анализам? Об этом и не только читайте ниже:

– Владислав Александрович, расскажите о преимуществах и недостатках данного метода исследования.

Недостатков у ПЦР-диагностики при условии строгого соблюдения технологии проведения анализа и чистоты материала, на мой взгляд, нет.

Главным достоинством данного метода является его высокая чувствительность и возможность обнаружения самого возбудителя как в качественном, так и в количественном отношении. Определение количества микроорганизмов служит хорошим подспорьем для лечащего врача, так как позволяет оценить степень поражения, а также эффективность проводимого лечения.

Бесспорным преимуществом ПЦР-диагностики является также пригодность различных видов биологического материала пациента: крови, мочи, кала, спермы и т.д. В одном образце материала можно обнаружить нескольких возбудителей. К плюсам ПЦР-диагностики я бы отнёс и то, что это аппаратная методика, практически исключающая субъективизм в оценивании биологического материала.

Беседовала Севиля Ибраимова

Редакция также рекомендует:

Для справки:

Чередниченко Владислав Александрович

В 2000 году закончил Донецкий государственный медицинский университет им М. Горького по специальности «Лечебное дело».

В 2002 году закончил магистратуру в Украинской военно-медицинской академии (г. Киев) по специальности «врач-инфекционист».

Заместитель медицинского директора по развитию региона в «Клиника Эксперт» Воронеж. Принимает по адресу: ул. Пушкинская, д. 11.

  • Поделиться:
  • ВСТУПАЙТЕ В НАШИ ГРУППЫ:

Другие статьи по теме

Что такое С-реактивный белок? О чём может рассказать врачу результат анализа на. Анализ на С-реактивный белок: для чего он нужен?

Несмотря на множество теорий развития злокачественных опухолей специалисты и сегодня нередко затрудняются. BRCA1 и BRCA2: что делать, если обнаружена мутация в этих генах?

Что значит «мазок на цитологию» в гинекологии? Как прочитать его результаты и. Мазок на цитологию: как правильно расшифровать?

Рейтинг
( Пока оценок нет )
Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: