Апоптоз: определение, функция, примеры и тест

Апоптоз: определение, функция, примеры и тест

2 ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Росздрава», Санкт-Петербург

Проведена сравнительная оценка результатов измерения апоптоза в клетках костного мозга больных хроническим миелолейкозом в условиях индукции двумя методами: флуоресцентной микроскопией и проточной цитометрией. Микроскопия выполнена с применением красителя акридин оранж. Проточная цитометрия выполнена с применением аннексина V и пропидий йодида. В исследование включены две группы больных: группа больных в хронической фазе с полным или частичным цитогенетическим ответом и группа больных в фазе бластного криза. В условиях индукции у больных в хронической фазе обнаружена высокая апоптотическая активность клеток костного мозга, у больных в фазе бластного криза – низкая. Выявлена высокая сопоставимость результатов оценки апоптотических реакций в клетках костного мозга при определении методом флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.

1. Зимина В.А. Особенности апоптотической активности клеток костного мозга у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами: дис. . канд. мед. наук. – СПб., 2003. – С. 61–62, 78–79.

2. Chronic Myeloid Leukemia: An Update of Concepts and Management Recommendations of European Leukemia Net / M. Baccarani, G. Cortes, at al: // J. Clin. Oncol. – 2009. – Vol. 27. – P. 6041–6051.

3. Endometrial carcinoma in vitro chemosensitivity testing of single and combination chemotherapy regimens using the novel microculture kinetic apoptosis assay: implications for endometrial cancer treatment / K.S. Ballard, H.D. Homesley, C. Hodson et al. // J. Gynecol. Oncol. – 2010. – Vol. 21, № 1. – P. 45–49.

4. Tracking infrared signatures of drugs in cancer cells by Fourier transform microspectroscopy / G. Bellisola, M. Della Peruta, M. Vezzalini et al. // Analyst. – 2010. – Vol. 135, № 12. – P. 3077–3086.

5. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry / Z. Darzynkiewicz, S. Bruno,G. Del Bino et al. // Cytometry. – 1992. – Vol. 13, № 8. – P. 795–808.

6. Griffin C., Hamm C., McNulty J., Pandey S. Pancratistatin induces apoptosis in clinical leukemia samples with minimal effect on non-cancerous peripheral blood mononuclear cells // Cancer. Cell. Int. – 2010. – Vol. 10. – PP.6. doi:10.1186/1475-2867-10-6.

7. Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death / D. Hockenbery, G. Nuсez, C. Milliman et al. // Nature. – 1990. – Vol. 348 (6299). – P. 334–336.

8. Kerr J.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetics // Br. J. Cancer. – 1972. – Vol. 26 – P. 239–257.

Апоптоз представляет собой процесс физиологической клеточной смерти, который контролируется генетически и присущ всем клеткам человека [8]. Понимание молекулярных механизмов, вовлеченных в регуляцию апоптоза, способствует выяснению нарушений процессов клеточного роста при различных заболеваниях [7]. Факторы, вовлеченные в регуляцию процесса апоптоза, в настоящее время рассматриваются в качестве основных клеточных мишеней целенаправленной терапии в онкогематологии, а изучение характера апоптотических реакций под ее воздействием может служить лабораторным маркером эффективности и помогать в выборе рациональной химиотерапии [3]. Для качественного и количественного определения направленности апоптотических реакций в клетке был предложен ряд методов, позволивших раскрыть многие механизмы, лежащие в основе апоптотической и некротической клеточной смерти.

Целью настоящего исследования явилась сравнительная оценка результатов измерения апоптоза в клетках костного мозга больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ) в условиях индукции двумя методами: флуоресцентной микроскопией и проточной цитометрией.

Материалы и методы исследования

Исследование было проведено на гетерогенной популяции клеток костного мозга (КМ) у больных ХМЛ в хронической фазе (ХФ) (n = 14) – первая группа и в фазе бластного криза (БК) (n = 6) – вторая группа. У больных 1-й группы был получен полный гематологический ответ и полный или частичный цитогенетический ответ на терапию гливеком. Больные 2-й группы были включены в исследование до начала терапии гливеком. Разделение на группы было проведено на основе цитогенетических и клинико-гематологических данных согласно критериям European Leukemia Net [2].

На момент обследования у больных 1-й группы количество бластных клеток в КМ составило не более 1,2 ± 0,7 %, а у больных 2-й группы – 47,1 ± 11,9 %. Количество клеток с Ph(+) хромосомой у больных 1-й группы было в пределах 0-26 %. У больных 2-й группы Ph(+) хромосома определялась в 100 %.

1. Выделение клеток костного мозга

Клетки КМ были выделены с помощью центрифугирования в градиенте плотности раствора фиколл-верографин с относительной плотностью 1,077 г/мл из 2 мл гепаринизированного костномозгового пунктата, полученного при стернальной пункции. После центрифугирования (40 минут при 1500 об./мин) отделяли клеточную фракцию, которую трижды отмывали раствором хлорида натрия 9 г/л. Выделенные клетки суспендировали в среде следующего состава (ммоль/л): NaCl – 119; KCl – 4,69; CaCl2 – 2,52; MgCl2 – 1,18; глюкоза – 5,5; KH2PO4 – 1,18; HEPES – 25; pH = 7,4 с добавлением 60 г/л раствора ЭДТА в соотношении 1/20 от объема костного мозга из расчета 1 мл раствора на 106 клеток.

Читайте также:
Вскрытие: определение, метод и виды

На каждом этапе выделения клеток подсчитывали их количество в камере Горяева и определяли жизнеспособность по связыванию трипанового синего. Жизнеспособные клетки составляли в среднем 92-99 % от их общего числа.

2. Оценка апоптоза

Интенсивность апоптотических реакций в клетках КМ оценивали двумя методами: флуоресцентной микроскопией и проточной цитометрией.

2.1. Флуоресцентная микроскопия

Интенсивность реакций апоптоза оценивали по количеству клеток, связавших акридин оранж (АО) [1]. На предметное стекло помещали 5 мкл клеточной суспензии, содержащей клетки КМ, смешивали с равным объемом раствора АО (100 мкг/мл), затем накрывали покровным стеклом и просматривали под масляной иммерсией (Микроскоп Leica DM4000B, светофильтр H3). Изображение фиксировали с помощью видеосистемы на основе цифровой камеры. Подсчитывали не менее 100 клеток в разных полях зрения. Количество клеток, связавших АО (АО+ клетки), выражали в процентах от общего числа.

2.2. Проточная цитометрия

Интенсивность реакций апоптоза оценивали по связыванию клетками КМ двух маркеров – аннексина V и пропидий йодида (PI) с помощью набора реактивов ANNEXIN V-FITC APOPTOSIS DETECTION KIT I
(«BD Pharmingem TM », США). Результаты выражали в процентах от общего числа клеток. Аннексин V применяли для выявления клеток, вступивших в апоптоз (аннексин V+ клетки). Пропидий йодид (PI) употребляли в качестве маркера жизнеспособности клеток (аннексин V-PI- клетки) и клеточного некроза (аннексин V- PI+ клетки). В каждом образце анализировали 10000 клеток. Мононуклеарные клетки костного мозга идентифицировали на основе CD45 флюоресценции. Анализировали недифференцированный клеточный пул по общему лейкоцитарному маркеру CD34 (CD34+ клетки).

3. Индукция апоптоза

Об апоптотической активности клеток КМ судили по разнице в количестве клеток в условиях спонтанного и индуцированного апоптоза. Для оценки спонтанного апоптоза 4∙106 клеток инкубировали в 1 мл инкубационной среды. Индукцию апоптоза вызывали дефицитом глюкозы в среде инкубации, помещая то же количество клеток в минимальный объем среды (50 мкл). Количество клеток в состоянии апоптоза определяли после 18-часовой инкубации при температуре +37 °С.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 6.0. Сравнение было проведено с использованием непараметрического метода Манна-Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение

При изучении клеток в условиях флуоресцентной микроскопии учитывали следующие признаки: размеры ядра, характер распределения хроматина, наличие хроматиновых тел в цитоплазме, характер свечения ДНК. Акридинсвязывающая способность клеток была изучена во всех образцах КМ больных, включенных в 1-ю и 2-ю группы. Полученные данные представлены в табл. 1, из которой видно, что уровень спонтанного апоптоза и индуцированного в клетках КМ у больных ХМЛ в 1-й группе намного выше, чем у больных 2-й группы. Прирост количества АО+ клеток КМ в условиях индукции апоптоза в 1-й группе более чем в 10 раз превышает их прирост во 2-й группе (9,5 и 0,7 % соответственно).

Таблица 1

Связывание акридин оранжа клетками костного мозга
при спонтанном и индуцированном апоптозе

Апоптоз: молекулярно-клеточные механизмы развития, значение в обеспечении клеточного гомеостаза.

В работе представлены современные данные литературы, относительно механизмов развития апоптоза, его принципиальных отличий от некроза, значение в поддержании клеточного гомеостаза в лимфоидной и других пролиферирующих тканях.

Ключевые слова

Статья

Апоптоз — форма гибели клетки, проявляющаяся в уменьшении ее размера, конденсации и фрагментации хроматина, уплотнении цитоплазматической мембраны без выхода содержимого клетки в окружающую среду. (Попков В.М., Чеснокова Н.П., Барсуков В.Ю., 2011).

Апоптоз играет жизненно важную роль в процессе эмбрионального и онтогенетического развития, имеет место при различных морфогенетических процессах, обеспечивает поддержание клеточного гомеостаза как в лимофоидной ткани, так и в других пролиферирующих тканях. Нарушение апоптоза в эмбриогенезе может приводить к внутриутробной гибели плода, врожденным уродствам или различным заболеваниям, в том числе и злокачественным новообразованиям.

Различают два типа гибели клетки: апоптоз и некроз. Принципиальные различия заключаются в следующем: некроз является результатом незапланированного события и происходит спонтанно, апоптоз формируется как четко – регулируемый, генетически-детерминируемый процесс элиминации клетки. Отличительной морфологической чертой апоптоза является коллапс ядра. Хроматин становится суперконденсированным в форме полумесяца по периферии ядра, в этот момент начинается фрагментация ДНК. Характерными признаками апоптоза, позволяющими отличить его от некроза, являются:

а) переход фосфатидилсерина из внутреннего монослоя цитоплазматической мембраны в наружный монослой; выход цитохрома С из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму

б) активация цистеиновых протеиназ (каспаз)

в) образование активных форм кислорода

г) сморщивание (blebbing) цитоплазматической мембраны

д) последующий распад ядра на части

е) фрагментация клеток на везикулы с внутриклеточным содержимым — апоптотические тельца

ж) апоптотические тела захватываются фагоцитирующими клетками микроокружения, как в случае некроза. При развитии апоптоза выброса клеточного содержимого не происходит, воспаление не возникает. Некроз распространяется обычно на группы клеток, в то время как апоптоз носит селективный характер в отношении отдельных клеток (Дмитриева Л.А., Максимовский Ю.М., 2009).

Стадии апоптоза

Стадия инициации. На этой стадии патогенный агент либо сам является информационным сигналом, либо обусловливает генерацию сигнала в клетке и его проведение к внутриклеточным регуляторным структурам и молекулам. Инициирующие апоптоз стимулы могут быть трансмембранными или внутриклеточными. Трансмембранные сигналы подразделяют на отрицательные и положительные. Отрицательные сигналы обусловливают отсутствие или прекращение воздействия на клетку различных факторов роста, регулирующих деление и созревание клетки. Положительные сигналы генерируют запуск программы апоптоза. Так, связывание TNFα (FasL) с его мембранным рецептором CD95 (Fas) активирует программу смерти клетки. Среди внутриклеточных стимулов апоптоза зарегистрированы избыток Н+, свободные радикалы липидов и других веществ, повышенная температура, внутриклеточные вирусы и гормоны, реализующие свой эффект через ядерные рецепторы (например, глюкокортикоиды).

Читайте также:
Анатомическое Положение - определение и функция

Стадия программирования. На этой стадии специализированные белки либо реализуют сигнал к апоптозу путём активации исполнительной функции, либо блокируют потенциально летальный сигнал. Выделяют два варианта реализации стадий программирования: 1) путём прямой активации эффекторных каспаз и эндонуклеаз (минуя геном клетки) и 2) опосредованной через геном передачи сигнала на эффекторные каспазы и эндонуклеазы. Прямая передача сигнала осуществляется через адапторные белки, гранзимы и цитохром С. Опосредованная передача сигнала подразумевает репрессию генов, кодирующих ингибиторы апоптоза, и активацию генов, кодирующих промоторы апоптоза.
Стадия реализации программы состоит в собственно гибели клетки, осуществляемой посредством активации протеолитического и нуклеолитического каскадов.
Непосредственными исполнителями процесса «умертвления» клетки являются Ca2+,Mg2+ -зависимые эндонуклеазы и эффекторные каспазы. В результате разрушения белков и хроматина в процессе апоптоза клетка подвергается деструкции, когда в ней формируются и отпочковываются фрагменты клетки, содержащие остатки органелл, цитоплазмы, хроматина и цитолеммы, то есть апоптозные тельца.

Стадия удаления фрагментов погибших клеток. На поверхности апоптозных телец экспрессируются лиганды, с которыми взаимодействуют рецепторы фагоцитирующих клеток. Фагоциты быстро обнаруживают, поглощают и разрушают апоптозные тельца. Благодаря этому содержимое разрушенной клетки не попадает в межклеточное пространство. (Лихтенштейн А.В., Шапот В.С., 1998).

Одно из апоптотических событий реализуется в ядре клетки и заключается в фрагментации ДНК. Деградация ДНК является терминальной фазой апоптоза, связанной с проявлением активности различных эндонуклеаз, последние обусловливают либо появление крупных фрагментов ДНК, или развитие межнуклеосомальной деградации ДНК. Считают, что этот тип деградации обеспечивается активацией Са2+, Mg2+-зависимой эндонуклеазы.

Исследования последних лет привели к формированию принципиально новых представлений о механизме гибели клеток, имеющих повреждения ДНК, как о процессе, осуществляемом в соответствии с определенной генетической программой. В индукции этой программы при наличии повреждений в ДНК клетки важная роль принадлежит белку р53. Этот белок с молекулярной массой 53 кД, локализован в ядре клетки и является одним из транскрипционных факторов. Повышенная экспрессия этого белка приводит к репрессии ряда генов, регулирующих транскрипцию и причастных к задержке клеток в фазе клеточного цикла G1. Если же активность репарационных систем недостаточна и повреждения ДНК сохраняются, то в таких клетках индуцируется программируемая клеточная гибель, или апоптоз, что приводит к защите организма от присутствия клеток с поврежденной ДНК, т.е. мутантных и способных к злокачественной трансформации.
Таким образом, при действии генотоксических агентов р53 не только увеличивает время репарации ДНК. но также защищает организм от клеток с опасными мутациями. (Паукова В.С., Пальцева М.А., Улумбекова Э.Г., 2015).

Механизмы индукции апоптоза

Регуляция апоптоза обеспечивается гормонами, цитокинами и в значительной мере особенностями генома. Ослабление или устранение гормональных влияний на клетки- мишени приводит, как правило, к индукции апоптоза.

Цитокины – это обширная группа белков, регулирующих пролиферацию и дифференцировку клеток при связывании со специфическими рецепторами на клетках мишенях. Цитокины подразделяются на 3 большие группы: ростовые, семейство Фактора некроза опухоли и спиральные цитокины. Эффект цитокинов на клетки неоднозначен в связи с гетерогенностью их структуры и функции: для одних клеток ряд цитокинов выступают в роли индукторов апоптоза, а для других – в роли ингибиторов апоптоза. Это зависит от типа клетки, от стадии ее дифференцировки, от функционального состояния клетки. (Goodwin P.J., Ennis M., Pritchard K.I., 2002).

Наиболее хорошо изучена последовательность событий, приводящих клетку к апоптозу в результате взаимодействия белков из семейства TNFα со специфическими рецепторами. Ярким представителем этой группы белков является система Fas/Fas-L. Следует отметить, что для этой системы не известны другие функции, кроме как индукции апоптоза клетки. Взаимодействие Fas с Fas-L (лиганд) или с моноклональными антителами приводит к апоптозу клетки. При связывании лиганда с рецептором происходит олигомеризация цитоплазматических белков: (1) DD (домен смерти), относящийся к рецептору, (2) адапторного белка – FADD (Fas-ассоциированный домен смерти), содержащий DED – эффекторный домен смерти и (3) прокаспазы-8. (Паукова В.С., Пальцева М.А., Улумбекова Э.Г., 2015).

Важная роль в регуляции апоптоза клеток иммунной системы принадлежит другим цитокинам -интерлейкинам, интерферонам. Было обнаружено, что интерлейкины являются индукторами апоптоза как в здоровых, так и в малигнизированных клетках и клеточных линиях. Однако не только роль индукторов апоптоза свойственна интерлейкинам, не менее выраженный эффект цитокинов наблюдается в предотвращении апоптоза. При этом один и тот же IL может быть как индуктором апоптоза, так и его ингибитором. Так, например, IL 1 является индуктором апоптоза для клеток мышиной тимомы в случаях ингибирования размножения клеток и ингибитором апоптоза для этих же клеток в случаях их интенсивного размножения. Неоднозначна и роль интерферонов по влиянию на клетки. В одних случаях IFN вызывает апоптоз (клетки костного мозга), в других – является ингибитором апоптогенного сигнала (периферические моноциты человека).

Читайте также:
Антекубитальная Ямка - что такое и где находится на локте

Таким образом, апоптоз является тем механизмом, который обуславливает элиминацию клеток с определенной специфичностью рецепторов. (Миронова С.П., Котельников Г.П., 2013).

В настоящее время складывается впечатление о центральной роли протеаз в запуске и развитии процесса апоптоза. Причем, по-видимому, при апоптозе, в отличие от физиологического ответа клетки, действуют свои, характерные только для апоптоза, специализированные необратимые реакции протеолиза, катализируемые специфическими протеазами, относящихся к классу цистеиновых протеаз.

Роль наследственных факторов в регуляции апоптоза

Выяснение роли белков семейства Вс1-2 занимает центральное место в изучении регуляции процесса апоптоза. К настоящему времени известно, что белки этого семейства относятся либо к индукторам апоптоза (Bad, Bax, Bcl-Xs, Bik, Bid, Bak), либо к ингибиторам (Bcl-2, Bcl-XL). Белки семейства Bcl-2 находятся в постоянном динамическом равновесии, образуя гомо- и гетеродимеры, что в конечном счете влияет на развитие апоптоза клеток. Поэтому считается, что соотношение активных форм этих белков определяют реостат жизни и смерти клетки. (Попков В.М., Чеснокова Н.П., Захарова Н.Б., 2016).

Таким образом, апоптоз является общебиологическим механизмом, ответственным за поддержание постоянства численности клеточных популяций, а также формообразование и выбраковку дефектных клеток. Нарушение регуляции апоптоза приводит к возникновению различных заболеваний, связанных с усилением или, наоборот, ингибированием апоптоза. Следовательно, изучение механизмов регуляции различных этапов данного процесса позволит определенным образом воздействовать на его отдельные этапы с целью их регуляции или коррекции. В настоящее время общепринято: если клетка погибает от апоптоза – подразумевается возможность терапевтического вмешательства, если вследствие некроза – нет. На основе знаний о программированной гибели клетки используется широкий ряд препаратов с целью регуляции этого процесса в различных типах клеток.

Многообещающими являются также подходы, связанные с регуляцией апоптоз- специфических генов и реализующиеся, в частности, в генной терапии – одной из самых перспективных областей современной медицины – при лечении заболеваний, вызванных нарушением функционирования отдельных генов. (Макаренко Н.И., Поддубная И.В., Подрегульский К.Э., 2006).

Литература

1. Дмитриева Л.А., Максимовский Ю.М. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2009. – 912 с. – (Серия “Национальные руководства”)

2. Кочан Е.А. Молекулярно-генетические основы канцерогенеза // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. – 2002. – №3. – С. 32-36.

3. Лихтенштейн А.В., Шапот В.С. Опухолевый рост: ткани, клетки, молекулы // Патологическая физиология. – 1998. – №3. – С. 25-44.

4.Макаренко Н.И., Поддубная И.В., Подрегульский К.Э. Новые возможности лекарственной терапии злокачественных опухолей // – М., 2006. – С.27.

5. Миронова С.П., Котельников Г.П., / Национальное руководство / – 2-е изд., перераб. и доп. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2013. – 944 с.

6. Паукова В.С., Пальцева М.А., Улумбекова Э.Г. Опухолевый рост // 2-е изд., испр. и доп. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. – 2500 с.

7. Попков В.М., Чеснокова Н.П., Барсуков В.Ю., / Канцерогенез : патофизиологические и клинические аспекты/ – Саратов : Изд-во: СГМУ, 2011, 600 с.

8. Попков В.М., Чеснокова Н.П., Захарова Н.Б., под общ. ред. В.М. Попкова, Н.П. Чесноковой./ Цитокины: биологическая роль в развитии реакций адаптации и повреждения в условиях нормы и патологии различного генеза/ – Саратов: Изд-во Сарат. гос. мед. ун-та, 2016.-448 с.

9. Goodwin P.J., Ennis M., Pritchard K.I., Fasting insulin and outcome in early-stage breast cancer: results of a prospective cohort study// J.Clin. Oncol. – 2002. – Vol. 20. – P. 42-51.

Апоптоз: определение, функция, примеры и тест

Апоптозом называется запрограммированная клеточная гибель. Этот процесс играет важную роль в росте и развитии организма, т. к. по мере созревания тканей некоторые клетки должны погибнуть, чтобы уступить место более дифференцированным и специализированным.

Если клетка не умирает и становится бессмертной, может развиться злокачественная опухоль. Впервые апоптоз был описан в 1970-е годы, но только в последнее время исследователи осознали его важную роль для развития организма, дифференцировки тканей и малигнизации.

Интерес к апоптозу возрос, когда выяснилось, что этот процесс находится под контролем генов, вовлеченных в злокачественную трансформацию, т. е. онкогенов, протоонкогенов и генов-супрессоров. Очевидно, что многие из этих генов активны во время развития организма.
Полагают, что изучение апоптоза и путей его регуляции позволит понять механизмы развития организма и старения. Утрата клеточного контроля над программированной клеточной гибелью ведет к развитию опухолей.

Стадия инициации апоптоза

Стадия инициации апоптоза

Апоптоз — особый вид клеточной гибели, ответственный за устранение клеток в нормальных тканях. Тем не менее этот процесс наблюдается и при патологических процессах. Гистологически проявляется уменьшением клетки, буллезным разрушением клеточной мембраны и конденсацией клеточного ядра.

В итоге образуются апоптотические тельца, содержащие неповрежденные органеллы; окружающие клетки фагоцитируют эти тельца. Апоптоз не сопровождается воспалением, что отличает его от некроза. Последний сопровождается набуханием клетки, разрушением всех ее структур и развитием воспалительного ответа.

На молекулярном уровне при апоптозе происходит саморазрушение генома на мельчайшие фрагменты, осуществляемое ферментами самой клетки; в итоге при электрофорезе образующихся клеточных компонентов в полиакриламидном геле выявляется характерная «лестница» из фрагментов ДНК.

Стадия программирования апоптоза

Стадия программирования апоптоза

Читайте также:
Амнион это - определение и функция

Апоптоз играет важную роль в нормальном росте организма, а также в развитии и прогрессировании злокачественных опухолей. Спонтанный апоптоз встречается в злокачественных клетках и даже замедляет их рост.

Интенсивность этого процесса возрастает при облучении опухоли, проведении гормоно- и химиотерапии, при нагревании опухоли. В злокачественных опухолях апоптоз представляет механизм уничтожения клеток, в которых произошли канцерогенные изменения ДНК.

Однако если он заблокирован или подавлен мутациями контролирующих его генов, например BCL2 или ТР53, то эти клетки получают возможность свободно делиться и неограниченно накапливать мутации. Такая генетическая нестабильность — ранний этап развития злокачественных опухолей.

Стадия реализации апоптоза

Стадия реализации апоптоза

Многие из современных методов лечения, например лучевая и химиотерапия, направлены на уничтожение клеток за счет повреждения их ДНК. Мутации гена BCL2 или ТР53 ухудшают эффективность лечения, т. к. подавляют клеточную гибель.

Более глубокое понимание процессов запрограммированной клеточной гибели может привести к разработке новых, более эффективных методов лечения. Ингибиторы апоптоза (например, протоонкоген BCL2) могут быть ответственны за развитие резистентности к противоопухолевым препаратам, позволяя выживать клеткам с патологической ДНК.

Вероятно, в дальнейшем будут выявлены и другие механизмы подавления апоптоза. Не следует думать, что этот процесс отражает нечто иллюзорное в биологической литературе, а термин принят только для описания отличной от некроза клеточной гибели. Апоптоз — фундаментальный процесс, контролируемый на молекулярном уровне, и можно надеяться, что его удастся расшифровать и использовать для медицинских нужд. Возможные механизмы апоптоза представлены на рисунке.

Механизмы и факторы апоптоза

Возможные механизмы апоптоза и факторы, его контролирующие.
Внеклеточный сигнал запускает каскад событий, вовлекающий молекулы BCL2, BCL-xL и ВАХ.
Это ведет к наступлению программированной гибели клетки.
Этот механизм может быть заблокирован на любом из множества этапов, в результате чего клетка становится бессмертной.
ICE – интерлейкин-1b-превращающий фермент.

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

Апоптоз

Печать

Апоптоз – это процесс, который происходит в многоклеточных когда клетка намеренно “решает” умереть. Это часто происходит для большего блага всего организма, например, когда ДНК клетки стала поврежденной и она может стать раковой.

Апоптоз называют “запрограммированной” смертью клеток, потому что это происходит из-за биохимических инструкций в ДНК клетки; это противоречит процессу “некроза”, когда клетка умирает из-за внешней травмы или лишения.

Как и многие другие сложные клеточные процессы, апоптоз вызван сигнальными молекулами, которые говорят клетке, что пришло время совершить клеточное “самоубийство”.”

Два основных типа путей апоптоза-это “внутренние пути”, где клетка получает сигнал уничтожить себя от одного из своих генов или белков из-за обнаружения повреждения ДНК; и “внешние пути”, где клетка получает сигнал начать апоптоз от других клеток в организме. Внешний путь может быть вызван, когда организм признает, что клетка изжила свою полезность или больше не является хорошей инвестицией для организма, чтобы поддержать.

Апоптоз играет роль в причинении и предотвращении некоторых важных медицинских процессов. В людях, апоптосис играет главную роль в предотвращении рака путем причинять клетки с поврежденной ДНК совершить “суицид” прежде чем они могут стать раковыми. Он также играет роль в атрофии мышц, где тело решает что больше не будет хорошей идеей потратить калории на поддержании мышечных клеток если клетки регулярно не используются.

Поскольку апоптоз может предотвратить рак, и поскольку проблемы с апоптозом могут привести к некоторым заболеваниям, апоптоз интенсивно изучается учеными с 1990-х годов.

Функция апоптоза

Апоптоз является важной эволюционной адаптацией, поскольку он позволяет организмам разрушать их собственные клетки. На первый взгляд, это может показаться ужасной идеей. Зачем тебе уничтожать часть себя?

Ну, возможно, если бы эта часть вас стала опасной для остальных, как в случае с клетками с поврежденной ДНК, которые могут стать раковыми. Апоптоз является основным убийцей предраковых клеток, и люди с мутациями, которые препятствуют правильному функционированию апоптоза, имеют гораздо больше шансов получить рак.

Многоклеточные организмы могут также хотеть потерять клетки которые более не полезны к организму. Мы поделимся некоторыми действительно впечатляющими примерами того, когда смерть клетки является хорошей вещью ниже.

Примеры апоптоза

От Головастика до лягушки

Впечатляющий пример этого можно найти в лягушачьих головастиках, которые разрушают и повторно поглощают целые структуры тела, когда они превращаются в лягушек.

Клетки от жабр, плавников и хвоста головастика “говорят” умирать по сигналам апоптоза по мере созревания головастика. Сырье этих сфальшивленных клеток становится строительными материалами и пищей для их новых растущих конечностей.

Развитие Нервной Системы Человека

В начале развития человеческой нервной системы, огромное количество клеток погибает путем апоптоза. Почему это должно быть так?

Правда в том, что ученые не совсем уверены, почему так много запрограммированной смерти клеток происходит в развивающейся нервной системе. Некоторые думают, что это потому, что формирование правильных связей является сложным и потенциально трудным процессом для молодых нейронов; и потому, что максимальная эффективность нервной системы, безусловно, в интересах организма.

Нервы требуют огромного количества энергии для того, чтобы функционировать – на самом деле, нервная система потребляет около 20-25% всех калорий, потребляемых в организме человека!

Читайте также:
Аллантоис - Определение и функция

Нейроны также должны найти свой путь к очень точным целям. В начале развития нейроны растут из яростно делящихся стволовых клеток “родителей” и следуют химическим сигналам, чтобы попытаться найти правильные клетки-мишени для соединения. Между мозгом и кожей, между мозгом и мышцами, между нейронами в мозге и стержневыми и конусными клетками в сетчатке и т.д..

Чтобы создать этот невероятно сложный таргетинг, развивающаяся нервная система просто растет слишком много клеток. Те, которые эффективно соединяются с правильными целями, используются часто, и они сохраняются. Но те, которые не вступают в контакт эффективно и не используются, часто отмирают от апоптоза.

Может быть, эта теория о том, почему нейроны умирают во время развития, верна; также может быть, что ученые сделают важные открытия, о которых мы еще не мечтали, которые объясняют, почему в развивающейся нервной системе так много апоптоза. Больше исследований, безусловно, необходимо!

Ноги Мыши

Во время эмбрионального развития ноги мышей начинаются как плоские, лопатообразные вещи. По мере развития, ноги разделяются на пять различных пальцев по процессу – вы догадались-апоптоза! Клетки, которые соединяют пальцы, отмирают, чтобы создать четкие промежутки между ними.

Это пример того, как запрограммированная смерть клеток может быть использована для формирования полезных структур и создания полезных функций, в дополнение к избавлению от ненужных.

Апоптоз и рак

Одной из основных функций апоптоза является разрушение клеток, опасных для остальной части организма. Распространенной причиной апоптоза является, когда клетка распознает, что ее ДНК сильно повреждена. В этих случаях повреждение ДНК запускает пути апоптоза, гарантируя, что клетка не может стать злокачественным раком.

Однако, очевидно, что этот процесс иногда терпит неудачу. Все случаи рака, по-видимому, являются случаями, когда поврежденная клетка не совершала апоптоз, а вместо этого продолжала делать больше.

Apoptosis может быть неспособен произойти если необходимые гены необходимы для его среди тех которые повреждены. Однако, некоторые доктора и ученые изучали апоптосис интенсивно в надежде что они могут выучить вызвать его специфически в раковых клетках используя новые лекарства или другие терапии.

Как и все препараты, предназначенные для уничтожения раковых клеток, задача с препаратами, разработанными, чтобы вызвать апоптоз является, чтобы убедиться, что эти препараты только эффект раковые клетки. Лекарство, которое вызывает здоровые клетки, а также раковые, чтобы совершить запрограммированную смерть клетки может быть очень опасно.

Картина также может быть не так просто, как ” рак возникает, когда апоптоз терпит неудачу.”Исследования показали, что некоторые виды рака могут возникать в клеточных популяциях, где апоптоз протекает более легко, чем это должно быть; возможно, эти клетки были вынуждены” учиться”, чтобы игнорировать чрезмерно восторженные сигналы апоптоза, а затем не совершать апоптоз, даже если они получили серьезное повреждение.

Другие исследования показали, что раковые клетки, которые умирают из – за воздействия лекарств, часто умирают от апоптоза, что указывает на то, что раки, которые особенно устойчивы к апоптозу, также могут быть особенно устойчивыми к лечению.

Гораздо больше исследований необходимо по вопросу лечения рака, и понимание путей апоптоза является одним из чрезвычайно многообещающих путей для достижения новых прорывов!

Путь Апоптоза

Есть два основных типа путей апоптоза, каждый из которых иллюстрирует важный момент о том, как срабатывает апоптоз и почему это полезно.

Оба основных пути проиллюстрированы на рисунке ниже. Эти шаги более подробно рассматриваются в следующих списках:

Внешний Путь

В” внешнем ” пути к апоптозу из-за пределов клетки поступает сигнал, указывающий ей совершить запрограммированную смерть клетки. Это может произойти, если клетка больше не нужна, или если она больна.

Как и многие пути, приводящие к сложным изменениям в клетке, внешний путь к апоптозу включает в себя множество шагов, каждый из которых может быть “регулирован” или” понижен ” экспрессией Гена или другими молекулами:

Шаг 1:

Как и большинство сигналов между клетками, внешний путь апоптоза начинается с сигнальной молекулы связывания с рецептором на внешней стороне клеточной мембраны.

Два распространенных типа химических мессенджеров, которые запускают внешний путь к апоптозу, – это FAS и TRAIL. Эти молекулы могут быть выделяны соседними клетками если клетка повреждена или больше не необходима.

Приемные устройства которые связывают к FAS и следу вызваны “FASR” для “приемного устройства FAS” или “TRAILR” для “приемного устройства тропки.”

Как с большинств протеинами приемного устройства, когда встреча FASR и TRAILR к их молекуле сигнала – иногда вызываемой “лигандом” – они связывает к ему.

Связывая процесс причиняет изменения к домену приемного устройства внутриклеточному.

Шаг 2:

В ответ на изменения в внутриклеточном домене TRAILR или FASR, протеин внутри вызванной клетки FADD также изменяет.

Имя ФАДДА либо забавно, либо страшно: оно означает белок “FAS-Associated Death Domain”.

Как только FADD было активировано изменениями к приемному устройству, оно взаимодействует с 2 дополнительными протеинами, которые идут дальше начать процесс смерти клетки.

Шаг 3:

Pro-caspase-8 и pro-caspase-10 будут неактивными протеинами до тех пор пока они не будут взаимодействовать с активированным FADD. Но если две из этих молекул сталкиваются с активированным FADD, части белков, которые держат их неактивными, “расщепляются” или “срезаются”.

Читайте также:
Амниотическая жидкость: Определение, функция и развитие

Затем прокаспазы становятся каспазой-8 и каспазой-10, которые были романтически названы учеными “началом конца” из-за их роли в начале апоптоза.

Каспазы-8 и -10 рассеиваются через цитоплазму и вызывают изменения в нескольких других молекулах по всей клетке, включая мессенджеры, которые начинают пробой ДНК после активации каспазами.

Шаг 4:

Другая неактивная молекула, называемая БИД, преобразуется в тбид, когда активированные каспазы отделяются от части БИД, которая удерживает молекулу неактивной.

После того, как ставка превращается в tBID, tBID перемещается в митохондрии. tBID активирует молекулы BAX и BAK.

Активация BAX и BAK первые шаги, разделяемые как внешними, так и внутренними путями к апоптозу.

Шаги 1-4, перечисленные здесь, уникальны для внешнего пути. Но после активации BAX и BAK последующие шаги одинаковы между обоими путями.

Таким образом, шаги 3-7 внутреннего пути, перечисленные ниже, также являются шагами 5-9 внешнего пути!

Внутренний Путь

Шаг 1:

Внутреннеприсущий путь к apoptosis вызван усилием или повреждением к клетке. Типы стресса и повреждения, которые могут привести клетку к апоптозу, включают повреждение ее ДНК, лишение кислорода и другие стрессы, которые ухудшают способность клетки функционировать.

В ответ на эти повреждения или стрессы клетка “решает”, что ее дальнейшее существование может быть опасным или дорогостоящим для организма в целом. Затем он активирует набор белков, называемых “белками только BH3″.”

Шаг 2:

Белки только BH3 являются классом белков, включая несколько про – и анти-апоптоз белков. Апоптоз можно ободрить или обескуражить, в зависимости от что протеины BH3-only активированы или выражены.

Pro-apoptotic bh3-только протеины активируют BAX и BAK – такие же протеины которые активированы tBID после того как оно создано через extrinsic тропа к apoptosis.

Шаг 3:

Активированный BAX и BAK вызывают состояние, известное как ” MOMP.”MOMP стоит для” митохондриальная наружная проницаемость мембраны.”

MOMP считается “точкой невозврата” для апоптоза. Шаги водя до MOMP можно остановить в их следах молекулами ИА АБС битор, но как только MOMP было достигано, клетка завершит процесс смерти.

MOMP играет свою ключевую роль в апоптозе, позволяя высвобождать цитохром С В цитоплазму.

Шаг 4:

При нормальных обстоятельствах, цитохром С играет ключевую роль в митохондриальной электрон транспортной цепи. Во время MOMP, однако, цитохром C может избеубежать митохондрия и подействовать как молекула signaling в цитоплазме клетки.

Цитохром-С В цитоплазме клетки провоцирует образование зловеще-звучащей “апоптосомы” – комплекса белков, выполняющего заключительный шаг к началу клеточного распада.

Шаг 5:

Апоптосома после ее образования превращает прокапазу-9 в каспазу-9.

Как и при активации каспаз-8 и -10 во внешнем пути к апоптозу, каспаза-9 способна вызвать дальнейшие изменения по всей клетке.

Шаг 6:

Caspase-9 выполняет несколько функций для того чтобы повысить apoptosis. Среди наиболее важных является активация каспаз-3 и -7.

Шаг 7:

После активации каспазы-3 и -7 начинают разрушение клеточных материалов. Каспаза-3 конденсируется и разрушает ДНК клетки.

Когда Происходит Апоптоз?

Апоптоз возникает, когда существование клетки больше не полезно для организма. Это может произойти по нескольким причинам.

Если клетка была плохо усилена или повреждена, она может совершить апоптоз, чтобы предотвратить себя от стать опасным для организма в целом. Клетки с повреждением ДНК, например, могут стать раковыми, поэтому лучше для них, чтобы совершить апоптоз, прежде чем это может произойти.

Другие клетчатые стрессы, как лишение кислорода, могут также причинить клетку “решить” что опасно или дорог к хозяину. Клетки, которые не могут функционировать должным образом, могут инициировать апоптоз, так же, как клетки, которые испытали повреждение ДНК.

В третьем сценарии, клетки могут совершать апоптоз, потому что организм больше не нуждается в них из-за их естественного развития.

Одним из известных примеров является головастик, чьи клетки жабры, плавника и хвоста совершают апоптоз, как метаморфозы головастика в лягушку. Эти структуры необходимы, когда головастик живет в воде – но становятся дорогостоящими и вредными, когда он перемещается на сухую землю.

Проверка, тестирование усвоенных знаний по вопросам и ответам

1 вопрос теста. Что из следующего Вы не ожидаете вызвать апоптоз?
А. повреждение клеток ДНК
Б. -за длительного кислородного лишения
C. В организме переходят на новый этап своего жизненного цикла, формировании клеток, отживших
д. Ничего из вышеперечисленного

Д – это правильно. Все вышеперечисленное является потенциальным триггером апоптоза.

2 вопрос теста. Что из перечисленного может произойти, если мутация делает апоптоз невозможным?
А. нервная система не может развиваться должным образом
Б. Рак может стать гораздо более вероятно,
С. насекомое не могли пройти метаморфоз
д. Все перечисленное

Д – это правильно. Все возможные последствия для организма, клетки которого не могут вызвать апоптоз.

3 вопрос теста. В чем разница между внешними и внутренними путями апоптоза?
А. внешний путь запускается по сигналу из вне клетки, в то время как внутренний путь инициируется событий внутри клетки.
Б. внешний путь имеет больше шагов, потому что сигнал должен передаваться от клеточной мембраны.
С. Внешний путь активируется в BAK и BAX, а внутренний путь не.
Д. А и Б

Читайте также:
Паратиреоидный гормон , паратгормон - регулятор кальция в крови

Д – это правильно. Оба A и B-правда. Однако C неверен – и внутренние, и внешние пути к апоптозу должны активировать BAK и BAX, чтобы апоптоз был успешно завершен.

Ссылки на литературу

  • Wilson, J. H., & Hunt, T. (2002). Молекулярная биология клетки, 4-е издание: проблемы подхода. New York: Garland Science.
  • Lowe, S. W. (2000). Апоптоз в раковых. Канцерогенез, 21 (3), 485-495. doi: 10.1093 / carcin / 21.3.485

Данная статья размещена исключительно в общих познавательных целях посетителей и не является научным материалом, универсальной инструкцией или профессиональным медицинским советом, и не заменяет приём доктора. За диагностикой и лечением обращайтесь только к квалифицированным врачам, в государственных больницах и частных клиниках.

Если понравилась эта статья, можно легко поделиться с друзьями в соц. сетях или оценить эту запись тут: Поставить оценку:

Здравствуйте. Наша команда врачей авторов и редакторов сайта Simptom-Lechenie.ru, старается создать для Вас максимально качественный контент статей, выискивая и описывая важные медицинские нюансы и вопросы, о симптоматике, диагностике и лечении самых популярных заболеваний, и не очень известных синдромах. Рады помочь, проконсультировать – обращайтесь. Не занимайтесь самолечением, обращайтесь к врачам.

Современные методы определения апоптоза Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Левицкая А. Б., Никитюк Д. Б.

Взаимосвязь экспрессии гемоксигеназы-1 и активности апоптотических процессов в печени крыс при неалкогольном стеатогепатите

Участие некоторых гепатопротекторов и иммуномодуляторов в регуляции апоптоза гепатоцитов, индуцированного противотуберкулезными препаратами основного ряда

Текст научной работы на тему «Современные методы определения апоптоза»

ВЕСТНИК НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ – 2005 – Т. XII, № 3-4 – С. 33

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АПОПТОЗА А.Б. ЛЕВИЦКАЯ, Д.Б. НИКИТЮК*

Апоптоз – один из вариантов программируемой клеточной гибели, основное предназначение которого, как физиологического процесса – поддержание постоянного количества клеточных элементов в органах и тканях организма и удаление клеток, прошедших свой жизненный цикл. В отличие от гибели клеток, вызываемой патологией, процессы апоптоза происходят в ядре и цитоплазме при сохранении целостности клеточной оболочки [1]. Основными критериями, характерными для апоптоза, являются: функционально – необратимое прекращение жизнедеятельности клетки; морфологически – потеря микроворсинок и межклеточных контактов, конденсация хроматина, уменьшение объема клетки, ее фрагментация и образование апоптозных телец [2]; биохимически – гидролиз белков цитоплазмы и межнуклеосом-ный распад ДНК [1]; генетически – структурно-функциональная перестройка генетического аппарата клетки [3]. В мире приняты следующие основные методы определения апоптоза.

I. Морфологические: световая микроскопия гистологиче-

ских препаратов и полутонких срезов; электронная, фазовоконтрастная, поляризационная, флюорисцентная, электронно-

трансмиссионная микроскопия; сканирующая, световая и электронно-микроскопическая радиоавтография, с использованием радиоактивной метки; TUNEL- и ISEL-методы, используемые для оценки апоптоза в тканевых срезах с помощью встроенных в концевые фрагменты ДНК меченых нуклеотидов.

II. Биохимические: электорофорез в агарозном геле с компьютерной денситометрией электрофореграмм для количественного определения степени фрагментации ДНК; метод ДНК-комет, или метод электрофореза единичных клеток со сканированием комет; определение активности каспаз.

III. Иммунологические: использование поли- и монональ-ных антител для выявления рецепторов на поверхности клеток, продуктов онкогенов и антионкогенов, цитотоксинов, ростовых факторов и других структур, антител против каспаз, а также против белков, регулирующих процесс апоптоза.

IY. Иммуноцитохимические: детекция апоптоза по идентификации экспрессии фосфатидилсерина на наружной стороне мембраны клетки с помощью ФИТЦ-меченного аннексина и последующей люминесцентной микроскопией.

Y. Иммуногистохимические: использование специфических маркеров клеточного цикла Кь67 PCNA с обработкой срезов в СВЧ-печи. Оценку результатов проводят стрептовидин-биотинпероксидазным методом.

YI. Проточная цитофлюориметрия позволяет выявить число апоптотических клеток в популяциях лимфоцитов, тимоцитов, макрофагах, клеток культуры. Апоптотические ядра обнаруживаются как широкий пик гиподиплоидной ДНК, который легко отличим от узкого диплоидного пика ДНК нормальных клеток.

YII. Вестерн-блот анализ применяется для идентификации электрофоретически разделенных полипептидных цепей. В качестве зондов используются меченые антитела.

YIII. Биотехнологические: трансфекция клонируемого гена в соматические клетки животных и человека; создание трансгенных мышей для выяснения роли введенного гена в клеточном развитии и гибели клеток.

Изучен уровень апоптоза гепатоцитов при подостром токсическом гепатите, вызванном четыреххлористым углеродом. Для создания модели токсического гепатита крысам-самцам Вистар опытной группы в течение 9 дней вводили внутримышечно 50% раствор четыреххлористого углерода в оливковом масле в дозе 0,3 мл на 100 г. массы тела. Контрольные и опытные животные содержались на общевиварном рационе и получали воду ad libitum. Показано статистически малозначимое увеличение активности каспазы -3 – на 9,3% в печени крыс опытной группы по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы. Межнуклеосомной фрагментации ДНК гепатоцитов у животных как опытной, так и контрольной группы при этом не наблюдалось.

Поражение печени при действии 4-хлористого углерода сопровождается активацией каспазы-3 и не приводит к межнуклео-сомной фрагментации ДНК. По-видимому, при подостром токсическом гепатите, вызванном четыреххлористым углеродом, вклад процессов каспаза-зависимого апоптоза незначителен и гибель гепатоцитов развивается по другим механизмам [4].

Читайте также:
Брюшная полость - определение, органы

С помощью проточной цитофлюориметрии изучено влияние пребиотиков инулина и олигофруктозы на спонтанный апоп-тоз в клетках иммунной системы. Крысы самцы Вистар двух опытных групп в течение 28 дней содержались на изокалорийном полусинтетическом казеиновом рационе, в котором кукурузный крахмал заменяли на инулин или олигофруктозу (10 % по массе).

Контрольные животные получали стандартный полусинте-тический казеиновый рацион. Исследовались суспензии клеток тимуса, селезенки, брызжеечных лимфатических узлов и перитонеальных макрофагов. Установлено, что обогащение рационов крыс инулином и олигофруктозой не оказывало влияния на процессы апоптоза в клетках иммунной системы [5, 6].

Ныне наметилась тенденция к использованию количественных методов оценки апоптоза, таких как проточная цитофлюориметрия, определение активности каспаз, ТУННЕЛЬ-метод, электронная микроскопия и др. Учитывая неоднозначность признаков апоптоза, необходимо комплексное использование разных методов для определения и оценки апоптотической гибели.

1. Kerr J.F.R. et al. // Brit. J. Cancer.- 1972.- Vol. 26.- P. 239257.

2. Wyllie AH. et al. // Int. Rev.Cytol.- 1980.- Vol. 68.- P. 251306.

3. Лушников Е. Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз).- М, Медицина, 2001.- 192 с.

4. Левицкая А.Б., Москалева Е.Ю. // Мат-лы VIII Всерос. конгр. «Оптимальное питание – здоровье нации».- М., 2005.-С. 75.

5. Трушина Э.Н. и др. // Мат-лы 3-й Межд. науч.-иссл. конф. «Питание здорового и больного человека».- СПб.- 2005.- С.197.

6. Трушина Э.Н. и др. // Вопр. пит.- 2005.- №3.- С. 35^0.

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОГЛОЩЕННОЙ ЭНЕРГИИ ЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ПОЛЯ ПРИ УВЧ-ТЕРАПИИ

Воздействие в лечебных целях на организм человека электрическим или магнитным полем ультравысокой частоты (УВЧ) является одним из наиболее распространенных методов в физиотерапии [1]. На практике зарекомендовал себя способ УВЧ-терапии с применением конденсаторного варианта, когда объект помещается с воздушным зазором между пластинами вторичного (терапевтического) контура генератора. Количество поглощенной энергии и терапевтический эффект находится в зависимости от напряженности электрического поля (ЭП) между конденсаторными пластинами, их величины, формы и расположения относительно тела пациента. В связи с этим важной задачей является корректное определение (дозиметрия) энергии ЭП УВЧ, поглощенной в тканях и органах пациента в процессе воздействия.

Наиболее распространенным методом является дозиметрия по индивидуальным ощущениям пациентом чувства тепла в области воздействия ЭП УВЧ. Однако если даже и оставить в стороне неизбежный субъективизм этого метода дозиметрии, общность в критериях оценки поглощенной энергии ЭП УВЧ отсутствует. В отечественной физиотерапии различают три дозы: I – без ощущения тепла, II – с ощущением слабого тепла и III – с ощущением отчетливого тепла, тогда как в зарубежной практике используется принцип 4-х доз: I – отсутствие ощущения тепла, II

* ГУ НИИ питания РАМН

* Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, e-mail: per-off@front.ru

Апоптоз

«Апоптоз» в переводе с греческого означает «опадение листьев» — в современное клеточной теории это понятие означает вид «клеточной смерти», генетически строго контролируемый процесс, зависящий как от внутренних, так и от внешних факторов.

В последнее десятилетие были открыты многие белки и молекулы, лежащие в основе механизма апоптоза, выяснена природа клеточных процессов и сигнальных каскадов, регулирующих процесс апоптоза. Ранее биологи предпочитали говорить о «программированной клеточной смерти» (синоним апоптоза), поскольку этот термин подчеркивал значимость клеточной программы в форме генов и белков, активированных во время фазы регулирования и исполнения данного вида «смерти (гибели) клеток».

Апоптоз — активный процесс, и часто ведет к активации каспазы. В отличие от некроза, при котором «смерть клетки» наступает после механического или патологического повреждения мембран и клеточных органелл и процесс которого сопровождается воспалительной реакцией с последующим выделением, участвующих в реакциях цитокинов, при апоптозе последние выделяются лишь в незначительном количестве.

С морфологической точки зрения параметры апоптоза включают в себя конденсацию хроматина и разложение ДНК на 180bp интернуклеосомальные фрагменты из-за эндонуклеазы, активированной каспазами. Во время апоптоза в клетке присутствуют фрагменты ДНК с большой молекулярной массой (50-300 kbp), отражающие активацию факторов, разрушающих ДНК, например, фактора, индуцирующего апоптоз.

Отметим, что иногда встречается такая разновидность «смерти клетки», которая включает в себя как признаки некроза, так апоптоза («параптоз»). «Параптоз» описан в «жизни» эпителиальных клеток 293Т, причем «смерть клетки» была вызвана ни антиапоптозным белком Bcl-X, ни с участием ингибиторов каспаз (клеточная смерть была вызвана активацией каспазы-9 Apaf-1), зависящим способом.

С точки зрения психиатрии и неврологии представляет интерес тот факт, что некоторые субпопуляции нейронов могут иметь признаки апоптоза после различных повреждений (некроз после инсульта). Одновременное сочетание признаков некроза и апоптоза (разрушенные мембраны, фрагментированные ДНК) могут быть обнаружены в одном и том же нейроне. Более того, одни и те же химические вещества, например, каиновая кислота, стимулирующая глутаматные рецепторы нейронов и вызывающая эксайтотоксичность, могут привести как к апоптозу, так и к некрозу клетки. Вариант исхода в данном случае зависит от времени воздействия, концентрации активно действующего вещества, возраста организма и самого нейрона. Вообще нейронам свойственно подвергаться апоптозу, когда в наличие имеется достаточное количество энергии. Однако этот процесс может быть прекращен вследствие воздействия различных факторов, таких, как АТФ и функционирование митохондрий.

Читайте также:
Клетки животных - определение, функции и структура

Уровень свободных радикалов (активных форм кислорода — АФК) играет большую роль в регуляции апоптоза с помощью вовлечения клеточных органелл, включая митохондрии. Образование АФК и оксидантный стресс участвуют в развитии нейродегенеративных заболеваний (болезнь Альцгеймера). При травме головного мозга описана парадоксальная реакция ингибирования выработки АФК одновременно с увеличением числа клеток, подвергнувшихся апоптозу.

Апоптоз происходит в нормальных пределах среди различных популяций развивающихся нейронов, однако, морфология гибнущих клеток отличается от морфологии классического апоптоза, при этом замедляется и кинетика «смерти клеток». Возможно, что нейроны могут подвергаться и апоптозу и аутофагической дегенерации во время одного и того же патологического процесса. Одновременная активация протеаз и сигнальных путей, согласованно действующих в клетке, является общим мотивом при многих заболеваниях головного мозга, сопровождающихся дисфункцией и гибелью нейронов. Некоторые авторы предлагают заменить термин «апоптоз» понятием «активная клеточная смерть» (активация клеточных процессов), а «некроз» — «пассивная клеточная смерть».

Регуляторы апоптоза в медицине: успехи и проблемы

В научной литературе все чаще появляются работы, посвященные поиску регуляторов апоптоза. С какой целью проводятся такие исследования, рассказывает Анатолий Соловьев, д-р мед. наук, профессор, зав. отделом экспериментальной терапии и руководитель Межведомственной лаборатории доклинического изучения лекарственных средств ГУ «Институт фармакологии и токсикологии НАМН Украины»

— Анатолий Иванович, что следует понимать под термином «апоптоз» и каково его происхождение?

Solovyov_Anatoliy

— Если не углубляться в терминологические споры о правомочности отождествления и существующих якобы отличиях апоптоза и запрограммированной смерти клеток, то термин «апоптоз» в переводе с греческого означает «листопад» и был предложен еще Галеном. Так римский врач и естествоиспытатель назвал процесс, обусловливающий опадение листьев осенью. Тот факт, что листья опадают только с живых деревьев, в то время как спиленные или сломанные встречают зиму с побуревшей, но не опавшей листвой, позволил Галену сделать вывод о «запрограммированности» (говоря современным языком) отмирания листьев осенью.

Авторство современного термина принадлежит британским ученым Дж. Керру, Э. Уайли и А. Керри, которые в 1972 г. впервые выдвинули и обосновали концепцию о принципиальном различии физиологической запрограммированной смерти клеток (апоптоз) и их патологической гибели (некроз). В 2000 г. Дж. Керр был удостоен премии П. Эрлиха и Л. Дармштедтера за исследования в области апоптоза, а в 2002 г. ученые из кембриджской лаборатории, биологи С. Бреннер, Дж. Салстон и Р. Хорвиц, получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине (так часто бывает) за раскрытие основных механизмов генетической регуляции развития органов и исследования программируемой клеточной смерти. Ныне теории апоптоза посвящены десятки тысяч научных работ, раскрывающих основные механизмы его развития на физиологическом, генетическом и биохимическом уровнях. Проводится активный поиск регуляторов апоптоза. Особенно большой интерес представляют исследования, которые могут дать возможность практического применения регуляции апоптоза при лечении, прежде всего онкологических, аутоиммунных и нейродистрофических заболеваний.

— Каковы механизмы развития и регуляции апоптоза?

— Следует отметить, что это явление свойственно всем живым существам, включая человека. Каждый день в нашем организме погибают и замещаются новыми десятки миллиардов клеток, самоликвидация ненужных клеток абсолютно необходима для нормальной жизни организма.

Механизмы развития и регуляции апоптоза на сегодня до конца еще не изучены. Доказано, что процесс могут индуцировать низкие концентрации многих веществ, вызывающих некроз. Однако в большинстве случаев генетически запрограммированная гибель клеток происходит при поступлении сигналов от молекул — клеточных регуляторов, таких как гормоны, антигены, моноклональные антитела и др. Сигналы к апоптозу воспринимаются специализированными клеточными рецепторами, которые запускают последовательные этапы внутриклеточных сложных биохимических процессов. Одним из важных регуляторов апопотоза является белок р53 (такое невыразительное обозначение произведено от «протеин с молекулярной массой 53 килодальтона»), именно он запускает цепочку молекулярных процессов, которые и приводят к развитию апоптоза. Мутация этого белка нарушает механизм запуска гибели клеток, что может стать причиной развития ряда опухолевых заболеваний.

Читайте также беседу с Анатолием Соловьевым: Стволовые клетки: правда и вымыслы

— Какова роль апоптоза в химиотерапии онкологических заболеваний?

— Первые противоопухолевые лекарства либо химически повреждали молекулы ДНК и белков (алкилирующие соединения: эмбихин, мелфалан, метилнитрозомочевина, циклофосфамид и др.), либо препятствовали процессу удвоения нити ДНК (антиметаболиты, первые из которых, метотрексат и 5-фторурацил, были созданы еще в средине прошлого века и до сих пор применяются в онкологии). Позднее появились препараты, поражающие другие внутриклеточные мишени: противоопухолевые антибиотики (доксорубицин, блеомицин), вещества растительного происхождения (винбластин, паклитаксел, этопозид), комплексные соединения платины (цисплатин, карбоплатин).

Однако по мере развития представлений о механизмах программируемой клеточной гибели становилось очевидным, что практически все противоопухолевые лекарства, от препаратов «первой волны», упомянутых выше, до современных (гемзар, флудара, паклитаксел, гливек, ритуксимаб) весьма эффективно активируют программу клеточной смерти. Иными словами, цитотоксины не убивают клетки сами, а провоцируют их на совершение самоубийства. Несмотря на то, что у раковой клетки нарушены функции генетического самоконтроля, лекарства, активирующие программу клеточной гибели, преимущественно поражают все-таки именно клетки опухоли! В этом состоит один из основных парадоксов химиотерапии опухолей: система распознавания мутаций, поломка которой делает клетку восприимчивой к мутагенезу и приводит к ее опухолевому перерождению, представляет собой лишь часть «молекулярной кухни», реализующей программу клеточной гибели. Факт остается фактом — подавляющее большинство клеточных линий, т.е. стационарно поддерживаемых в культуре раковых клеток одного происхождения и используемых для поиска противоопухолевых лекарств, способно к гибели в результате апоптоза.

Читайте также:
Атавизм это - определение и примеры

— В чем же причина недостаточно высокой клинической эффективности лекарственных методов лечения онкологических заболеваний?

— Причина заключается в том, что полного исцеления можно достичь, только поразив все без исключения опухолевые клетки. Требования к лечению инфекционных и паразитарных заболеваний не столь суровы — уцелевших после лечения паразитов «зачищает» иммунная система. Раковые же клетки являются для организма «родными», иммунная система на них не реагирует, и если уцелеет хотя бы тысячная их часть, опухоль восстановится до начальных размеров всего через 10 делений (210=1024). Здесь и кроется основная трудность: истребить «одним ударом» все опухолевые клетки не удается, а в процессе длительного лечения происходит не только восстановление популяции, но и ее прогрессия с изменением свойств и спектра лекарственной чувствительности — всегда по направлению «от плохого к худшему». Вот почему химиотерапия наиболее эффективна на относительно ранних стадиях развития опухоли.

Читайте также беседу с Анатолием Соловьевым: Новые парадигмы классической фармакотерапии

Существует предположение, что и у онкологических больных клетки, утратившие программу клеточной гибели, могут возникать на разных этапах прогрессии опухоли независимо от того, какими лекарствами их лечат. И весь имеющийся арсенал специфических противоопухолевых средств оказывается бессильным перед таким клоном.

Эта ситуация — печальное следствие применяемой до настоящего времени методологии отбора новых противоопухолевых лекарств, при которой используют клеточные линии, в большей или меньшей степени сохраняющие способность к программированной гибели. В результате такого скрининга отбирают наиболее эффективные индукторы апоптоза, которые не представляют реальной опасности для опухолевых клеток, утративших к нему способность.

— Существует ли выход из такого тупика?

— Пока на этот вопрос нет ответа. Однако ученые обратили внимание на известный в радиобиологии феномен, называемый «репродуктивная гибель», которая наблюдается в том случае, когда полученные клеткой генетические повреждения становятся смертельными после одного или нескольких циклов удвоения ДНК. Если же смерть клетки от внешнего воздействия происходит до первого деления, то говорят об интерфазной гибели. Как это ни парадоксально звучит, причиной гибели клеток может стать утрата способности к апоптозу.

Читайте также беседу с Анатолием Соловьевым: Дорога в будущее: от нуклеотида к лекарству

Интересно отметить, что «обычные» раковые клетки сохраняют способность к апоптозу, поэтому та их часть, которая получила опасные повреждения, самоликвидируется, но зато оставшиеся клетки продолжают размножаться и опухоль продолжает существовать. Клеткам же с утраченной программой гибели ничто не препятствует бесконтрольно накапливать мутации и другие потенциально опасные повреждения, которые могут и не приводить к смерти в интерфазе, но будут препятствовать нормальному процессу клеточного деления и разрушать работу генов, что, в конце концов, создаст ситуацию, несовместимую с дальнейшей жизнью. Поэтому появилась идея о том, что с клетками, на которые не действуют индукторы апоптоза, можно попробовать бороться иным путем: стимулировать образование в них мутаций, чтобы сумма возникших генетических повреждений привела к утрате жизнеспособности их самих и особенно их потомков. Для этой цели можно попытаться использовать супермутагены или хроническое облучение малыми дозами ионизирующей радиации. Я считаю, что такая идея является довольно оригинальной и имеет право на существование, однако, успех исследований во многом будет зависеть от правильного выбора модели для поиска активных соединений.

Конечно, существует опасность побочного влияния таких веществ и на клетки нормальных тканей, ведь мутации будут возникать и в их геномах. Но, в отличие от опухолевых клеток, в них продолжает действовать механизм генетического самоконтроля, не позволяющий тиражировать генетические дефекты в следующих поколениях. Насколько перспективным окажется использование супермутагенов в онкологии покажет будущее.

subscribe

— Можно ли привести пример получения конкретного эффекта от использования знаний об апоптозе не в онкологии, а какой-либо другой области?

— Отличным примером может служить полученный эффект в той области, которая является наиболее близкой мне по научным интересам, а именно — ишемии. Так, сотрудниками университета в Рочестере было установлено, что немалая часть клеток в ишемизированной зоне мозга погибает не в первые часы ишемии, а позже, в результате именно апоптоза. Они предложили использовать активированный протеин С, который, взаимодействуя с клеточными рецепторами, способен снижать содержание молекул белка р53 в зоне ишемии, что спасает до 65% клеток. Прекрасный результат!

Таким образом, польза знаний об апоптозе приобретает все более конкретные очертания и будет становиться более весомой, ведь интенсивные исследования в этой области продолжаются.

Рейтинг
( Пока оценок нет )
Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: